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病毒的分子生物学检测

发布时间:2017-09-19 00:00 作者:中国标准物质网 阅读量:881

一、核酸杂交

临床病毒学中快速诊断方法通常是检测标本中的病毒抗原,然而核酸杂交(nucleic acid hybridization)具有高度敏感性和特异性,斑点杂交(dot hybridization)广泛用于检测呼吸道、尿液标本中的病毒核酸。标本滴加到硝酸纤维素膜上,病毒DNA结合到膜上,在原位进行碱变性处理后,用放射标记或生物素标记的DNA探针,按碱基互补原则结合成双链,经放射自显影或其他检测手段就可以判定膜上是否有同源的核酸分子存在。

二、DNA印迹和RNA印迹

1. DNA印迹(Southern blot)将标本中提取的DNA,经琼脂糖凝胶电泳进行分离,继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上,固定后再与同位素或其他标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。

2. RNA印迹(Northern b1ot)在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳,继而按照Southern blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。但RNA变性方法与DNA不同,不能用碱变性,因为碱会导致RNA的水解。

三、聚合酶链反应

聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)是一种体外快速扩增特异性DNA片段的技术。PCR反应体系中含有模板DNA、引物、Mg2+、4种脱氧核糖核苷酸(dNTP)和TagDNA聚合酶,在高温94℃下变性,使双链模板解链为两条单链,在退火温度下使引物与模板DNA形成部分双链DNA,然后在60~72℃下,通过TagDNA聚合酶使引物从5'端向3'端延伸,随着4种dNTP的掺入合成新的DNA互补链,完成第一轮变性、退火和延伸反应循环,由于每一轮循环扩增的产物可作为下一轮扩增反应的模板,因此,理论上每一轮循环可使DNA数量增加一倍(反复25~30次,特异DNA序列片段以指数方式可扩增106倍以上。PCR扩增倍数=(1/X)n ,X为扩增效率,n为 PCR循环次数。通过这个技术,可使非常微量的DNA甚至单个细胞所含的DNA起始,产生微克(ug)量的PCR产物。经琼脂糖凝胶电泳,可见到溴化乙锭染色的核酸条带,扩增片段的大小取决于两引物的间距。此法较核酸杂交敏感、快速,已用于肝炎病毒、疱疹病毒等感染诊断,尤其适用于不易分离培养及含量极少的病毒标本,也可以用RT-PCR法扩增标本中的病毒RNA。近年发展起来的实时荧光定量PCR法还可以定量检测标本中的病毒DNA。

四、基因芯片技术

基因芯片(gene chip)技术的原理是将已知的基因探针大规模有序地排布于一小块硅片等载体上,与待检样品中的基因序列相互作用和反应,在激发光的顺序激发下,产生的荧光谱信号被接收器收集,经计算机自动分析处理数据得出结果,可以一次性完成大通量样品DNA的检测和分析。目前对已发现的病原性病毒的全基因测序已基本完成,为基因芯片技术的应用奠定了基础。

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