胚培养的方法

(一)取材和消毒

离体胚培养的材料选择因植物类型和实验目的而异。如果是培养成熟胚，一般应该选择大粒饱满的种子，利于培养。如果实验目的是对远缘杂交的胚进行培养以获得植株，则必须在杂种胚夭折之前，将胚或种子剥离下来进行培养。如需获取在特定发育时期的胚，首先要了解该物种的开花和结实习性，以保证取到所需材料。例如，禾谷类作物玉米幼胚的获得，在同一个穗上胚的大小有一定的差异，穗中部胚的发育要较两端早。如果对某种植物材料开花受精规律不十分清楚，则需进行预备试验，研究胚胎发育期和授粉天数的相应关系，为该物种实验取材提供依据。

外植体的消毒应先把整个胚珠进行表面消毒，消毒的方法和消毒剂应根据外植体的大小、表面特性等情况来确定。一般可以先采用洗涤剂漂洗，然后使用自来水冲洗，再用75％的乙醇进行几秒钟的表面消毒，0.1％氯化汞灭菌10～30min，最后在无菌条件下把胚剥离出来。由于大多数植物的胚处在珠被和子房壁的双重保护下，在剥离之前一直处于天然的无菌环境之中，因此不需要再进行表面消毒，即可直接置于培养基上培养。某些物种只能进行胚珠培养，则把整个蒴果进行表面消毒，然后在无菌条件下取出胚珠，接种在培养基上。

(二)胚的剥离

胚的成功剥离是进行胚培养的前提，一般是将灭菌后的材料在无菌条件下切开子房壁，用镊子取出胚珠，剥离珠被，再取出完整的胚。在操作过程中需要根据植物类型和实验目的进行胚的剥离。一般来讲，成熟胚的剥离较为容易，但有些植物的种皮较硬，在进行胚的剥离前需要进行软化处理，如浸泡在水中。在剥离过程中要注意保持无菌并尽量减少对胚的损伤。幼胚的剥离比较复杂，有的需要在解剖镜和特制工具的辅助下才能完成。

单子叶禾本科作物玉米(Zea mays)幼胚的剥离方法是将从田间取回的玉米穗(授粉后9～12d)逐层剥去苞叶，每剥去一层苞叶后用75％的乙醇喷洒表面，在超净工作台的无菌风口剥去最后一层苞叶，然后迅速放入超净工作台内。用手术刀将玉米种子顶部从大约1/3处切去，然后用镊子尖部从侧面种皮与胚乳的结合处插入，将玉米幼胚挑出。

(三)接种从胚珠中取出胚后要迅速接种到培养基上，以免影响其生活力。进行玉米幼胚培养时要注意胚的盾片向上。

(四)看护培养

在进行幼胚离体培养时，很多植物的幼胚在一般人工培养基上很难培养成功，尤其是对杂种胚的培养。Ziebur和Brink等(1951)将大麦幼胚放置在另一个大麦种子的胚乳组织中培养，比单独放在培养基中的效果好。Kruse (1974)把大麦和黑麦属间杂交未成熟胚放置到培养的大麦胚乳上进行培养，能够显著提高成功率。研究表明，培养基中含有同一物种或相近物种的离体胚乳对胚的生长发育有明显的促进作用(图2-2)。

影响胚培养效果的因素

在胚培养的过程中，影响培养成功的因素很多，其中主要有胚龄、培养基和培养条件等。

(一)胚龄

胚龄是指从授粉开始到离体的时间。胚发育的时期不同对培养的要求也不同，一般来说，胚龄越小，对培养条件的要求就越严格，进行培养时难度越大。胚龄大小与成活率呈正相关，特别是子叶期以前的幼胚培养，成功与否很大程度上取决于胚的大小。早期的研究结果表明，小于0.5mm的幼胚很难进行培养，因为幼胚细胞分化不完全，细胞可以逆转。陈冉光在进行一个葡萄(Vitis vini fera L.)品种‘白香蕉’的胚培养时发现，受精15d的幼胚很难发育成幼苗，而受精30d的幼胚可以正常成苗，并移栽成活。潘俨(2006)在对4个葡萄品种的杂交胚进行培养时发现即使不同的杂交胚处于相同的培养环境，出现最高发育率和萌发率的取胚时间少则相差5d(无核白)，多则相差15d(全球红)。

(二)培养基

胚培养成功与否的关键之一是能否为胚的发育提供适合的营养。胚龄的大小不同对培养基的要求不同，培养的胚对外源营养的要求随着胚龄的增加而渐趋简单。成熟胚培养时只要求含有无机营养元素、几种维生素和少量激素的基本培养基。Hanning (1904)进行十字花科的成熟胚培养时，只使用了一种无机盐和蔗糖营养液培养。而未成熟胚一般不能在这类简单培养基上生长，它们对营养的要求更为复杂，必须同时考虑无机营养、有机营养、生长调节物质等方面的因素。另外，对幼胚进行培养，培养基的渗透压、植物浸提物和胚乳看护培养也必须加以考虑。

1．基本培养基

胚培养的基本培养基主要分为成熟胚和未成熟胚培养基。前者主要有Tukey (1934),Randilph和Cox (1934)、White (1963)等培养基，后者主要有Rijven (1952)、Rappaport(1954)、Norsyog (1963)、MS (1962)、Nitch (1953)等培养基。

2.氨基酸

在培养基中加入氨基酸或其复合物能刺激胚的生长。最初Hanning (1904)认为天冬氨酰对促进胚的生长最有效。但后来的研究表明，对离体胚的生长最有效的氨基酸是谷氨酰胺。谷氨酰胺的常用浓度为500mg/L。除氨基酸外，水解酪蛋白也被广泛用做胚培养的附加物。其使用浓度因植物种类而异，如紫花曼陀罗(Datura stramonium L.)为50mg/L,栽培大麦最适浓度为500mg/L。除了氨基酸的作用外，水解酪蛋白对培养基渗透压的调节作用对胚培养也十分重要。

3．维生素

维生素一直被用于植物离体胚培养，一般对幼胚培养是必不可少的。但对于特定维生素的作用，文献报道不尽相同，甚至有相反的结论。因此，需要实验证实其在胚培养中的必要性后，再在培养基中加入维生素。常用的维生素有维生素B₁、维生素B₂、烟酸等。

4．蔗糖

在离体的成熟胚和未成熟胚培养中，一般都需要适量的蔗糖。在培养基中加入蔗糖有两个目的：一是为了保持适当的渗透压以刺激胚的正常生长，在自然条件下，原胚是被具有高渗透压的胚乳液所包围的，离体培养后若在低渗透压的培养基中，常常造成幼胚生长停顿，甚至死亡；二是可以作为一种碳源为胚生长提供所需的能量和碳元素。研究表明，蔗糖对于植物幼胚的离体发育具有一定的刺激作用，而高渗透压条件可以阻止离体幼胚早熟萌发。也有研究表明，高糖浓度会诱导产生较多的胚性愈伤组织从而导致不定胚的形成。然而，Raghavan等认为，胚在离体条件下的生长和分化在很大程度上并不依赖于渗透压的大小，而主要取决于某些生长调节物质的存在与否。宋西德(2010)的研究结果表明，柴松胚培养基中不同量的蔗糖对柴松种胚芽增殖的影响差异显著，蔗糖为3％时平均不定芽数目最多。除蔗糖外也有使用甘露醇、果糖等作为碳源的。

5．植物浸提物

Van Overbeek等(1942)在培养曼陀罗时发现，在培养基中添加不经高压灭菌的椰子汁，可以使原来不能发育的心形胚正常成苗。研究表明，椰子汁中存在对胚培养有促进作用的因子，这些因子也称为“胚因子”。“胚因子”的发现是胚培养史上的一个转折点，此后在很多类植物的幼胚培养中都使用了“胚因子”。刘晓青(2006)在研究大花蕙兰(Cymbidi-um grandi f lorum)胚培养时发现，10％椰子汁有利于培养。除椰子汁外，其他植物提取物也能用于离体胚的培养，如水解酪蛋白、干酵母、脱脂牛奶、银杏胚乳浸提物、被子植物种子浸提物等。

6．激素

不同植物和不同时期的胚培养对激素的需求很不一致。对于成熟胚培养来讲，培养物已成为组织，可自己合成生长发育所需要的激素，但未成熟的胚在培养过程中受激素类型和配比的影响。最近的研究表明，离体幼胚自身合成的内源激素不能满足其正常的发育，这是早期幼胚培养不易成功的原因之一。离体培养过程中加入一定量的生长素和细胞分裂素可以刺激组织的发育。IAA可以促进向日葵(Helianthus annuus)幼胚的生长，却抑制陆地棉幼胚生长。李林(2004)在进行白皮松(Pinus bungeana Zucc.)离体胚培养与不定芽的诱导时发现，激素不利于不定芽的生长。

诸多植物激素中，生长素常被用于诱导体胚发生、细胞分裂和根的分化。周健等(2008)的研究表明，茶树(Camellia sinensis)幼胚的萌发需要有一定量生长素的刺激，但较高浓度的细胞分裂素对茶树幼胚的萌发具有抑制作用，所使用的激素种类对胚的再生途径有较大的影响。

细胞分裂素可以促进也可以抑制体胚发生，浓度为0.5～30mg/L，但大多数植物的适宜浓度为1～2mg/L。王力超(1995)在大花君子兰(Clivia miniata)的幼胚培养中发现，在NAA浓度相同时，低浓度的细胞分裂素有利于发芽成苗，KT的发芽率高于同浓度的BA，且出芽快。周健等(2008)在茶树幼胚的培养中发现，细胞分裂素的最适浓度为0.1mg/L，较高浓度的细胞分裂素对茶树幼胚的萌发具有抑制作用。孙清荣(2002)在进行早熟油桃(Prunus persica)胚培养时发现，6-BA有解除种子休眠的作用，较高水平的BA，不仅有利于胚的生长增大，而且有利于胚芽的萌发生长。

ABA对于胚培养具有显著影响。Ahn等(1978)发现，随着大豆(Gl ycine max)胚的成熟，减少ABA可使胚培养的离体能力增强。Quatrano和Rajasekeran等(1987)研究表明，在种子胚发育期间，内源ABA作为正的调节因子起着重要的作用。内源ABA可使胚正常发育成熟及抑制过早萌发。在未成熟胚培养中，外源ABA能加速形成某些特殊储藏蛋白质。近年来的一些研究表明，未经处理的种子含有大量的ABA和微量的赤霉素类物质。在低温处理过程中，ABA含量降低并消失。另有研究表明，6-BA可促进ABA降解。

7．活性炭

有研究表明，活性炭通过间接的吸附作用改变培养基中生长调节剂的有效浓度，通过吸附对外植体分化发育有害的物质而在培养过程中发挥积极作用。卜学贤(1988)的研究表明，lmg的活性炭大约能吸附lot.g的生长调节剂。活性炭最常用的浓度为0.02～10g/L。朱际君等(1983)在培养基中加入活性炭能促进早熟桃的胚萌发成正常苗，且促进根系生长，幼苗健壮，提高试管苗的质量。李林(2004)的研究表明，培养基中加入1％的活性炭有利于白皮松离体胚培养不定芽的形成和生长。崔波(2007)在进行红头兰(Tuberolabium quisumbingii)胚培养时，活性炭对红头兰胚的萌发有重要的影响，未添加活性炭不但萌发率低于添加活性炭的，而且圆球茎和小植株易发生褐化。

8.pH

培养基的pH对胚培养也十分重要，合适的 pH能确保其正常生长发育。在一般情况下pH为5～7.5。对于不同的植物，胚的生长有一定最适的pH，如大麦为4.9～5.2、水稻为5～9。Norstog等(1963)研究表明，大麦未成熟胚培养基的pH对器官分化至关重要，最适值约为4.9。当pH在5.2以上时，胚虽能生长，但不发生明显的分化。培养基的pH也常会受一些因素的影响。例如，高压灭菌会使pH下降0.4～1.0，为了弥补高压灭菌过程中pH的变化，在配制培养基时可以将pH上调0.5。

(三)培养条件

1．温度

大多数植物的离体培养温度为25～30℃。不同的植物类型对温度的要求也不相同，有的需要较高的温度，有的需要较低的温度。起源于低纬度地区的喜温植物要求较高的温度，而起源于高纬度地区的耐低温植物所需的温度相对较低。例如，马铃薯的最适温度为20℃,棉花的最适温度为32℃。也有研究表明，在昼夜采用不同的温度有利于胚培养。Ayotte等(1987)报道，对花椰菜(Brassica oleracea)的胚培养应采取白天20℃、夜间16℃的培养条件。

2．光照

幼胚培养对光照的需求因植物种类而异，光对某些植物的胚胎发育并不很重要，但对某些植物却有很大影响。黄仕周(1992)在进行无籽蜜橘的幼胚培养时，接种后置于光下比事先暗培养9d再转入光培养下的生根率高。不同植物对光质的反应也不同。桂耀林(1985)进行的烟草(Nicotiana tabacum)胚培养试验表明，诱导烟草愈伤组织形成芽，其关键的光质是蓝光，红光没有效应。此外，光强对于胚培养有重要影响。不同植物对光强的反应也不同。有研究表明，香雪兰幼胚需18001x的光照强度，梨的幼胚需要25001x的光照强度。

(四)胚柄的作用

在被子植物中，胚柄是指受精卵第一次分裂形成的基部细胞经几次分裂构成的组织，位于原胚的胚根一端，存在时间较短。胚柄对胚早期的正常生长发育是必不可少的。胚柄对胚培养的作用可能是胚柄细胞内富含原生质，可以供胚以营养物，还能分泌一些激素促进胚的发育，胚柄中具有较高的赤霉素活性。例如，红花菜豆心形胚柄中的赤霉素活性比胚体高30倍。Cionini等(1976)发现在幼胚培养中，去掉胚柄就会显著降低成苗率。也有研究表明，在培养基中添加一定浓度的赤霉素能有效地取代胚柄的作用。