植物组织培养的研究与实验最先是从易于培养的植物中取得突破的，然后向其他植物(包括重要经济植物)拓展。因此，突破基因型的限制一直是植物组织与细胞培养的主攻方向。其中，研究和优化培养条件是最重要的手段之一。

(一)培养基中化学成分的影响

植物组织细胞培养中所用培养基的化学成分较为复杂，大体上可归为生长调节物质、无机物、有机物、附加物和天然添加物五大类。

1.培养基中生长调节物质的影响起着重要而明显的调节作用。使用激素要注意它们的种类和浓度，因为各种生长物质对器官形成的影响及其效应有明显的差别。同时，也要注意不同激素处理的顺序。

植物生长素的主要作用是使植物细胞壁松弛，从而使细胞增长，在许多植物中还能增加RNA和蛋白质的合成。最常用的生长素是IAA, NAA和2,4-D，所需浓度依生长素类型和愈伤组织的来源而有不同。1946年首次分离的天然植物生长素就是吲哚乙酸(IAA)。在对吲哚乙酸化学结构和生理活性相互关系进行深入研究的基础上，人工合成了与生长素化学结构及生理效应相类似的有机化合物，统称为人工合成生长素，常用的包括2,4-D,NAA和IBA等。
细胞分裂素(cytokinin)是一类促进细胞分裂、诱导芽的形成并促进其生长的植物激素。最初分离鉴定的细胞分裂素是6糠基-腺嘌呤，并命名为激动素。1964年从幼嫩的玉米种子里分离出一种细胞分裂素，命名为玉米素(zeatin,ZT)。细胞分裂素都是在N₆位置上的H被其他基团取代的嘌呤衍生物。激动素可以人工合成。除了天然的促进细胞分裂的物质外，还用化学方法人工合成了一些类似激动素的物质，通常也统称细胞分裂素。其中活性较强，在植物组织培养中常用的是6-BA。

在多数植物组织培养中，外源生长素和细胞分裂素是细胞离体培养所必需的激素。两者不同浓度和比例或先后配合的应用不但可诱导细胞分裂和生长，而且能控制细胞分化和形态建成。早在20世纪50年代就有学者发现腺嘌呤／IAA的比例是控制芽和根形成的重要条件之一。IAA对芽形成的抑制作用可以被腺嘌呤或腺苷所克服，而腺嘌呤/IAA值高时，利于形成芽；这一比例低时，则形成根。后来发现由激动素代替腺嘌呤其诱导芽的效果更好。因此，人们确认了芽和根的形成主要受培养基中生长素和激动素两类物质的相对浓度控制，即较高浓度的生长素利于根的形成而抑制芽的形成；相反，较高浓度的激动素促进组织的芽的形成而抑制根的形成。当然，在促进芽和根的形成时，并不是哪一种激素越高越有利于器官发生，而是有一个合适的范围。超出这个比例范围反而不利于器官的分化。这就表现出了两种激素相辅相成的作用。尽管观察到生长素和细胞分裂素之间有着某种相互作用的关系，但决定器官类型的形成显然不是两种激素的比例，而是培养基中生长素的绝对含量。在水稻愈伤组织的器官分化中也有类似的情况，当由加有不同生长素(2,4-D, NAA或IAA)的培养基上诱导形成的愈伤组织转移到不加任何生长物质的培养基上时，即可分化出芽和根。这些情况的发生可能与材料本身的生理状态，尤其是其细胞中内源激素的合成和代谢的差异有密切关系。

胚状体的分化，在很大程度上被愈伤组织或悬浮细胞培养及继代培养中生长素的延续作用所影响。在一些情况下，如激素的种类、激素的浓度对培养中再生的方式和器官分化的类型可以产生不同影响。2,4-D是诱导体细胞胚发生的重要激素，早在20世纪60年代就有学者建立了胡萝卜体细胞胚发生体系。胡萝卜是一个经典的研究体细胞胚发生的好材料，它在含有2,4-D的MS培养基中就可诱导愈伤组织的形成；当转移到无2,4-D的MS培养基中，可诱导体细胞胚的形成与发育。这表明培养基中促进组织增殖的激素并不适合于胚状体的分化，去除培养基中的2,4-D则可促进胚状体的形成。在矮牵牛茎、叶组织切块的培养中，用同一浓度(1mg/L)不同种类的生长素处理可得到不同的结果。IAA只引起愈伤组织有限的生长。NAA可引起根的大量形成。2,4-D则促进愈伤组织产生，培养2周后还有胚状体发生等。用2,4-D做进一步的浓度试验发现，2,4-D的浓度为0.1～0.5mg/L时可有效诱导所有材料形成胚状体；当提高2,4-D浓度至2mg／L，愈伤组织虽生长良好，但却抑制胚状体的形成，使诱导频率明显降低。在多数植物培养中均已看到2,4-D对促使胚状体的发生虽有微妙的良好效果，但对胚状体的进一步形成和发育均有抑制的倾向。实验证明，枸杞胚性愈伤组织形成后，如不及时降低或去掉2,4-D，则胚性细胞不能正常发育。在三叶草、芹菜的组织培养和细胞悬浮培养中诱导体细胞胚发生后，如不及时降低2,4-D的浓度，球形胚就产生次生胚，从而抑制了体细胞胚的正常发育。所以，为了促进培养物分化，只有在继代培养时及时降低或去掉2,4-D，胚性细胞才能正常发育。

然而，一些实验证明，生长素和细胞分裂素的配合应用对愈伤组织生长、细胞分裂和分化表现出明显的促进作用。单子叶植物，如小麦等诱导体细胞胚发生不仅需要高浓度的2,4-D (2～8mg/L)，还需要细胞分裂素(如KT)的配合使用。在含有2mg/L 2,4-D和0.5mg/L KT的MB (MS大量元素、B₅微量元素)培养基上诱导普通小麦幼胚的愈伤组织，经过多次继代后，仍能在含有0.5mg/L ZT和0.2mg/L NAA的MS培养基上获得较好的再生能力。青扦(Picea sil sonii Mast)胚性愈伤组织在含有2,4-D和KT浓度均为lmg/L的改良59培养基上继代培养3年后，仍能保持旺盛的增殖能力。该胚性愈伤组织转入含有lmg/L ABA的1/2改良59分化培养基上，约3个月可分化出大量体细胞胚。体细胞胚分化率达90％以上，而且遗传十分稳定。

在一些情况下，所用激素种类及浓度调节着培养外植体的再生方式及其器官分化类型。例如，对矮牵牛的茎、叶组织切块进行培养时，分别使用浓度均为lmg/L的3种不同种类生长素时，IAA仅引起有限的愈伤组织生长；NAA引起大量根形成；2,4-D促进愈伤组织形成，有时也有根产生，培养15d后能观察到胚状体的形成。在这个材料中试验不同浓度2,4-D的作用时，人们也发现高浓度的2,4-D促进愈伤组织生长而明显降低胚状体的形成。为了使胚状体分化形成小植株，则需要去除2,4-D。但当加入细胞分裂素(KT,ZT和6-BA)时，则改变了再生的方式，促进芽的形成。这种由于培养基中使用激素种类的不同，而导致产生不同的再生植株方式，在其他植物中也可观察到。

细胞分裂素对促进体细胞胚的成熟有显著作用，特别有利于子叶的发育。细胞分裂素可能专一性地调控体细胞胚的成熟。例如，只有ZT能促进胡萝卜体细胞胚胎发生过程，而6-BA, KT无促进作用，有时，细胞分裂素对胚生长分化成植株是有帮助的。此外，细胞分裂素在低密度培养中显得特别有效。

在其他植物激素中，一般认为在培养基中加入赤霉素(GA₃)不利于器官发生或胚状体的形成，这在烟草、水稻等多种植物中已得到证实，在胡萝卜的细胞培养中GA₃也有类似的作用。在菊芋的块茎组织培养中，人们发现GA₃单独使用时对菊芋组织并无明显作用，而与NAA一起使用时，在黑暗培养中则明显促进根的大量形成，但在光照的条件下却表现出抑制作用，即形成少量的根。尽管赤霉素在多数情况下对器官和胚状体的形成表现出抑制作用，但对已形成的器官或不定胚的生长却有促进作用。例如，在檀香、柑橘、珍珠粟、玉米胚培养中，GA₃对胚成熟、发根和次生生长都是有益的。在花菱草的培养中，GA₃的使用可解除其体细胞胚的休眠。

2．培养基中无机营养成分和有机营养成分的影响

至于培养基中无机营养成分和有机营养成分的影响，相对来说没有植物激素的作用那么明显。一般来说，在培养基中通常已经包含植物细胞生长所必需的无机元素和有机营养物质。即使有一些植物有某种特殊的需要，对培养基稍作改变也能使之适用。各类无机元素在植物生长和发育中的作用与氮素一样，是植物细胞生长和发育所必需的元素。但是，培养基的选择也能影响胚胎发生培养效果。在胡萝卜的细胞培养中，观察到培养基中高含氮量和低生长素对促进胚状体的发生是有益的。同时也证实不同的氮源对胚状体形成有不同的作用效果。NH₄⁺对诱导胚状体形成常优于其他氮源，用NH₄⁺和水解酪蛋白的促进作用也明显优于NO₃^-或谷氨酰胺。但在烟草的花药培养诱导胚状体的形成中并没有发现NH₄⁺对促进胚状体的形成有何作用。

目前，已发现一些金属离子在植物组织培养中对促进体细胞的形态发生有十分重要的作用。钾离子对体细胞胚胎发生是必需的，在低氮素水平条件下，不适当钾离子浓度的影响特别明显。铁盐也是影响体细胞胚胎发生的一个重要元素，在以小麦胚的外胚叶和盾片为材料进行胚性愈伤组织诱导实验中，证明了铁元素对胚性愈伤组织的诱导和分化是必需的。铁在烟草花药培养中对胚状体的形成也具有十分重要的作用，在胚胎发生的花药培养中，以ED-TA螯合型铁盐的培养效果为好。在缺铁的情况下，胚不能从球形期发育到心形期；在普通烟草和颠茄的花粉胚培养中也观察到这种现象。其他元素，如锌和锰等均不能代替铁的作用。Kiyosue等在未用任何激素处理的条件下，在添加有CoC1₂, NiC1₂, CuC1₂, ZnCl₂和CdCl₂的MS培养基上诱导了胡萝卜体细胞胚的形成，发现以应用CoC1₂的效果最佳。在小麦愈伤组织诱导体细胞胚发生中，也发现Zn²⁺、Cu²⁺, Co²⁺和Mn²⁺等具有重要的促进作用，不仅可提高诱导频率，而且可以加速胚性愈伤组织的形成，所以在培养基中加入适合浓度金属离子可提高体细胞胚发生的频率。

培养基中维生素、核酸碱基、氨基酸和糖类等有机化合物为植物的生长发育提供两类营养物质。一类有机营养物作为植物的生理活性物质，在植物代谢中起一定的作用，在很多情况下常用水解酪蛋白或水解乳蛋白、麦芽汁、酵母提取物和椰子汁等一些天然复合物，它们能促进培养物的器官或胚状体的形成；大量研究表明，这些天然物质中影响生长和分化的有效成分是细胞激动素类物质和肌醇等。例如，在培养基中加入肌醇和硫胺素有益于植物组织培养；在紫雪花茎切段的培养中发现，腺嘌呤不但能促进芽的形成，而且可以增强细胞激动素对芽形成的促进作用；后来证明腺嘌呤的这一效应不能被其他嘌呤及其嘧啶类所替代。另一类有机营养物为植物细胞的生长发育提供了碳源和氮源，在适宜含量的激素条件下，增加无机磷、酪氨酸和苯丙氨酸，或两种氨基酸结合使用，可促进烟草组织培养中器官的形成；其他氨基酸或酰胺类(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺)在有些情况中也表现出有益于器官的增殖。

培养基中碳水化合物的需要能很容易得到满足，其中糖类对诱导植物体细胞胚胎发生也是不可缺少的重要成分，常用的糖类是蔗糖、葡萄糖和果糖。在枸杞的体细胞胚发生的实验中，蔗糖的浓度为3％～6％的条件下，体细胞胚的诱导频率可维持在一个较高的水平。但当蔗糖浓度达到9％时，由于影响到细胞生长的渗透势，也就抑制了体细胞胚的发生与发育，因而体细胞胚的诱导频率显著下降。胡萝卜体细胞胚的发育在高浓度的葡萄糖(6％～10％)下更有利；半乳糖能够促进柑橘胚珠愈伤组织的体细胞胚的发育。因此，在某些情况下，变换培养基中糖类对体细胞胚的发育是有益的。

诚然，在培养条件中，器官和胚状体发生受多种因素的制约，但是，可以肯定的一点是培养基成分中激素的作用最为明显。所有这些影响因素与器官和胚状体发生的关系，是科学工作者在不同的植物实验中得出的，并带有一定的经验性质，所以部分结果之间会存在不同程度的差异。因此，我们应该根据不同属、科和种的植物，来区分这些限制因素对它们的决定作用。

(二)培养基物理性质的影响

培养基的物理性质包括培养基是固体状态还是液体状态、培养基的渗透压和pH等。

培养基是固体还是液体状态对离体组织或细胞的生长发育，甚至器官分化的影响较大，而对体细胞胚的形成和发育影响很小。一些资料表明，它主要对组织细胞的形成发生有一定的影响。例如，在进行烟草植物组织细胞培养时，当把其愈伤组织由液体培养基转到固体培养基中时，它立即分化出苗。又如，在胡萝卜和石刁柏的培养过程中发现，在培养过程中需要改变培养基的形式，才能顺利分化出苗。研究者认为，第一阶段诱导形成愈伤组织，应在固体培养基上进行；第二阶段细胞和胚状体的增殖，需在液体培养基中完成；第三阶段由胚状体发育成可移栽的植株，又应转移到固体培养基上进行培养。人们在水稻组织培养中发现，不同的琼脂浓度对水稻愈伤组织的诱导和植株再生也有明显的影响。在使用琼脂培养基时，重要的是要考虑琼脂的浓度和质量。琼脂浓度过高，会导致培养基太硬，外植体获取的养分和生理活性物质也会减少，这将抑制组织细胞的生长。用质量较差的琼脂，其所含杂质会对细胞的生长造成不良影响，如果加入活性炭于培养基中，可在烟草花药培养中显示出良好的效果，使形成胚状体的花药数大大增加。

培养基的渗透压对培养愈伤组织细胞的增殖和胚状体的发生有着重要影响。培养基中渗透压的高低通常由蔗糖、葡萄糖、果糖、甘露醇和山梨醇等糖类物质来调节，其渗透压的改变影响愈伤组织中胚状体或器官的分化形成。例如，油菜花药培养宜先放在高糖浓度(9％～10％)培养基中培养，才能有利于细胞增殖和胚状体的形成。胡萝卜和水防风的细胞悬浮培养时，在无生长素的MS基本培养基中能诱导形成胚，但在MS培养基中若加入12％蔗糖或其他能提高渗透压的物质(如甘露醇和山梨醇)，形成的胚发育得比较小，其形态比正常的MS培养基上的更像合子胚，这种影响类似于在胚胎培养中所观察到的现象。培养基中含较高浓度琼脂糖可明显提高愈伤组织的绿苗分化率(盛腊红等，1999)。

在培养过程中，培养基中的pH常常随着培养基中的水分丧失和养分消耗，会发生一定的变化，难以保持恒定。通常把培养基中的pH调整到5.6～6.0，过高、过低都会对培养物造成不利影响，以培养基中pH为5.8时效果最佳。

(三)培养的环境条件

植物组织培养的外部环境条件包括光照条件、温度条件、湿度条件和气象条件。在这些条件中，对器官和胚状体形成有较大影响的主要是光和温度。在干燥地区或干燥季节，由于培养基迅速丧失水分，从而改变了培养基的渗透压。通常认为，在水稻组织培养中，适当脱水处理有助于促使愈伤组织恢复紧密、颗粒状的组织结构特征，是一种提高植株再生率的培养方法。Jain等(1996)对水稻愈伤组织进行干燥处理，植株再生率比对照提高了3倍，并显示24h脱水处理效果最好。干燥处理在野生稻组织培养中也取得了较好的效果(谭光轩等，1997)。环境中的气体成分一般不易控制，所以较少被人们研究。

在植物组织细胞离体培养中，光照的作用并不是仅仅提供光合作用的能源，因为最初培养的组织细胞是处在异养条件下的，培养基中已有足够的碳源(蔗糖)供利用。光照对培养的植物组织细胞的作用是一种诱导效应，诱导植物组织细胞脱分化与再分化。在各种植物组织培养中，植物组织细胞的脱分化和再分化对光照的要求是不同的。在烟草、荷兰芹的组织培养中，器官的发生不需要光照，百合、虎头兰的小鳞茎和原球茎的生长发育也不依赖于光照。但多数植物组织细胞的培养都需在一定的光照下进行。例如，在进行菊芋块茎组织培养时，发现光照对根形成有促进作用，最佳光照强度在40001x左右。对于体细胞胚的发生，在普通烟草的胚培养中，其体细胞胚的形成需要高光照；而在胡萝卜属的胚培养中，胚能在完全黑暗的条件下完成较正常的胚成熟。

通常情况下，在诱导器官形成时，对光照强度没有特殊的要求，而由器官或胚状体已分化形成的小植株，较强的光照有利于其以后移至土壤的存活及生长。然而，光照强度及光周期对有正常光周期植物的影响非常明显。例如，对短日照敏感的葡萄品种茎切段培养中，仅在短日照培养条件下，茎切段才能形成根；而对于日照不敏感的品种，对光照的要求则不严格，在任何光周期下均可产生根。在对长日照植物菊苣的根段进行培养时，长日照条件下可以诱导根段形成花芽。而在对短日照植物紫雪花的茎节培养时，仅在短日照条件下才能诱导节间组织形成花芽，在长日照条件下无此作用。

对光质作用的阐明，早在1969年就发现蓝光对烟草愈伤组织分化形成小植株有促进作用，在白光或蓝光下形成相当多的芽，而远红光和红光则没有促进作用。光质对根的形成作用正好与芽相反。在菊芋块茎组织培养中，观察到红光对根的形成有促进作用。在促进对根的形成作用上，远红光和红光有较强的促分化作用，日光次之，蓝光和黑暗则有抑制作用。

在植物组织细胞培养中，一般都采用24～28℃的恒温条件进行培养。通常在这样的温度条件下都可使植物组织细胞较好地生长，并能再分化形成芽和根。但是也有资料表明，有些植物组织细胞甚至需要更低或更高的温度。例如，培养温度在18℃时，对烟草组织培养时苗的形成有良好的促进作用，高于33℃和低于12℃对苗的形成都不利。菊芽在白天26℃和夜间15℃的变温条件下，能最好促进根的形成。因此，培养室的温度最好能保持有一定的昼夜温差。在不同温度条件下培养秋海棠的离体叶片有明显不同的再生表现，15～18℃时促进芽的形成，而27℃或超过27℃的高温时，芽的形成就会完全被抑制；但在较高温度下却能迅速形成大量的根。经过低温处理的菊苣根切段愈伤组织易分化形成花芽，而在25℃条件下培养则利于分化形成营养芽。所以，对于一些要求有季节温差的植物，温度处理能够快速促进器官分化使之成为小植株，从而打破植株休眠，利于正常生长。

湿度和气象条件对植株组织培养材料的影响仅有较少的研究。一般要求培养室的相对湿度为70％～80％，并保持良好的空气质量。湿度过高易引起棉塞生长霉菌，造成污染。有资料表明，氧气浓度过高可促进胡萝卜悬浮培养细胞胚状体的形成，过低则利于愈伤组织的生长和根的分化发育，但也有人持相反观点。

综上所述，要进行器官分化及建立高效的植株再生体系，除了寻找各种适宜的培养方法及最佳的培养因子之外，下面一些影响植物转化再生的问题也应该引起我们足够的重视：不同植物种类；同种植物不同的基因型；同种不同地理环境来源的植物；外植体的来源；培养组织的大小及其所处的生理状态；愈伤组织继代培养时间，等等。