一、细胞学遗传基础

(一)外植体细胞先存的变异

在大多数被子植物的体细胞再分化过程中经常发生染色体多倍化现象。多倍化的程度因组织而异，同一组织内的细胞之间也不一致。对于这些多倍体变异，目前有一种解释是产生于植物体内已有的多倍体细胞的启动分裂。由于在进行分化的植物组织中，DNA不断周期性复制而不进入有丝分裂，结果就产生核内多倍体细胞。这些细胞在正常情况下不再分裂，但在离体培养条件下却能诱导分裂，从而导致愈伤组织细胞的多倍体变异。在葱属和豌豆属中采用放射自显影技术证明，在所培养的外植体中，原有的多倍体细胞开始启动有丝分裂，在烟草、玉米等植物中也有同样现象发生。例如，在玉米胚乳培养中，即使培养基中没有生长素，内多倍体细胞也能诱导分裂。

(二)染色体数量变异

除少数植物，如还阳参、向日葵的培养细胞可完全或基本保持二倍体外，绝大多数植物愈伤组织都会呈现不同程度的染色体变异。其中，再生植株的染色体数量变异被认为是无性系变异发生的最主要证据和来源，也是人们最容易鉴别和接受的变异类型。染色体数量变异包括非整倍体(aneuploid)、单倍体(monoploid)、多倍体(polyploid)、双二倍体(amphi-diploid)和混倍体(mixoploid)，其中以非整倍体发生的频率最高。

有学者发现，在大麦、小麦、玉米、水稻、马铃薯、甘蔗等组织培养的愈伤组织、再生植株或原生质体中出现大量的染色体数量变异。例如，Singh (1986)在大麦愈伤组织培养中就观察到了单倍体(2n=X=7)、三倍体(2n=3X=21)、四倍体(2n=4X=28)和八倍体(2n=8X=56)的细胞，说明愈伤组织细胞的遗传组成具有明显的多态性。对双二倍体或部分双二倍体的判定，最初是统计这些植株在减数分裂期的染色体配对频率和C值，而在远缘杂种中由于经常出现一些不明的促进配对基因或不联会的基因，因而掩盖了真实染色体(组)间的亲缘关系。精确的分析方法是利用染色体分带(chromosome banding)或染色体原位杂交(genomic in situ hybridization)等技术。

另外，不同植物属间杂种的再生植株中也能够产生双二倍体和部分二倍体的变异，但变异频率较低。对于这些非整倍体变异，若是外源染色体有选择性丢失的结果，那么这些材料在遗传分析和育种实践上将有很大价值。例如，在栽培大麦和芒颖大麦草的杂种再生植株中，发现有5％～10％的单倍体或近等单倍体，所丢失的染色体均为外源染色体，而且在丢失之前已经与大麦染色体发生了相互易位。类似研究发现，野生种不同，其与栽培大麦间杂种再生植株的非整倍体表现丢失染色体的情形不同，有的是外源染色体丢失，有的是大麦染色体丢失。

混倍体(又称为镶嵌现象)也是一种常见的染色体数量变异类型，它可能是植株表型镶嵌变异的遗传基础，但表型的镶嵌性变异并非由混倍体现象引起。关于混倍体产生的机制目前主要来自组织学(histology)的研究结果。一般认为，在体细胞胚胎发生和直接器官发生形成再生植株的两种途径中，后一种途径中由多细胞芽分生组织所形成的再生植株个体中有一些将成为混倍体。王关林等(1989)在小麦和中间偃麦草杂交后代F2代再生植株培养中获得了1株混倍体，该混倍体能够自交结实，所得的种子均具有相同的2n染色体数。

(三)染色体结构变异

在植物组织培养中，除可以发生染色体数量变异外，还可以发生染色体结构变异。它是所有无性系变异中最有应用前景的一种类型，是产生体细胞变异的主要机制，也是最难阐明的一种变异类型。大量的染色体结构变异起源于离体培养过程。通过对不同物种再生植株的花粉母细胞减数分裂进行检查发现，易位、缺失、倒位、重复、着丝粒和无着丝粒片段交联、等臂染色体、端着丝粒染色体、双着丝粒染色体、双随体染色体和超级常染色质片段等变异类型大量存在。

染色体结构变异很容易造成遗传物质的重排和丢失，这可能也是引起再生植株表型变异的原因之一。结构变异不仅使染色体断裂处的基因受到影响，而且会使邻近的基因，特别是调节转录的基因受到干扰。染色体结构变异中的易位、倒位、重复和缺失会由于基因位于一个新的位置而诱导一种新的表型，这种“位置效应”的间接遗传学效应可以改变基因表达的时间和组织特异性，且能彻底改变基因的表达程度。遗传上的重排既可以导致一些基因的丢失和“静止”基因的活化，也可丢失或在一些情况下关闭某个显性基因从而使隐性基因表达。另外，双着丝粒染色体还能够通过有丝分裂过程中的“断裂一桥一融合”产生不对称姐妹染色单体的交换，从而周期性地产生缺失一重复。

一般来说，在体细胞无性系变异再生植株中，染色体数目和结构变异越多，其代谢损伤就越严重，生长也就越弱，其育种实际利用价值也就越低。但是，也有不少研究发现，在马铃薯、甘蔗、小麦和水稻的多种表型变异无性系中，染色体结构和数目并没有发生变化，说明细胞学遗传变异仅能解释少数的、较极端的无性系变异类型，而更多的无性系变异可能是生物体内DNA分子水平的变异。

二、分子遗传学基础

随着分子生物学的发展，特别是分子标记技术在体细胞无性系变异研究中的应用，人们逐渐认识到体细胞无性系DNA水平的变异可能有基因突变、碱基修饰、基因重排、DNA总量变化、转座因子的激活等类型，从而为无性系变异的深入研究提供了分子遗传学基础。

(一)基因突变

基因突变是指基因序列中的碱基发生改变，被认为是体细胞无性系变异的重要来源。植物组织和细胞在离体培养过程中，经过愈伤组织脱分化和再分化的过程，常常会引起基因突变，其中单基因突变在许多植物上都已表现出来，且大多数可稳定遗传。对玉米、烟草和水稻的研究发现，单基因突变的再生植株后代表现出典型的孟德尔隐性遗传。

利用分子生物学技术可以检测单基因突变。Brettell (1986a)从645株玉米杂种胚培养的再生植株中，通过Southern印迹分析，发现1个稳定遗传的Adhl(玉米乙醇脱氢酶)位点突变体，表现为孟德尔单基因遗传控制；对突变基因Adhl-Usu进行克隆和序列分析发现，该突变基因第6号外显子上发生了单碱基对的改变，编码谷氨酸的三联体密码GAG中的A转换为T，使肽链中的谷氨酸转变为缬氨酸。Dennis等对玉米组织培养中的突变体Adhl-ls等位基因进行碱基分析，发现该基因发生无义突变，编码赖氨酸的密码子AAG突变为终止密码子TAG，使原肽链不能合成。

目前，对于体细胞无性系变异中的单基因突变，一般采用分子生物学技术进行检测。但对于多基因突变来说，检测比较困难。而植物中的许多重要性状，如品质、产量等又都是由多基因来控制的，因此采用分子生物学技术与方法进行体细胞无性系突变检测的研究还有待进一步开展。

(二)碱基修饰

有些植物组织器官经一段时间的离体培养后，基因组中的碱基会发生某种化学修饰，从而影响细胞内基因的表达。DNA甲基化(DNA methylation)是细胞中最常见的一种DNA共价修饰形式，是基因表达调控的一种方式。在真核生物DNA中，2％～7％的胞嘧啶(C)存在着甲基化修饰，这种修饰作用广泛分布于基因组的各序列中。甲基化发生的位点通常在基因5'端的5'-CpG-3'(偶尔为5'-CpNpG-3')的胞嘧啶碱基上。

对DNA甲基化的研究，一般采用Hpa Ⅱ和,MspⅠ两种甲基化敏感的限制性内切核酸酶。这两种酶的切割位点都是CCGG, Hpa Ⅱ识别并切割未甲基化的CCGG序列，但对甲基化的CG对(CmG)则不起作用；加MspⅠ识别并切割所有的CCGG序列，故可用于识别CCGG序列的存在与否。大豆5S RNA基因在染色体上呈线性排列，内含2个CCGG内切核酸酶位点，经Hpa Ⅱ分析，在整体植株中胞嘧啶(C)被甲基(-CH₃)所修饰；但在经过短期培养后的细胞中则发生了去甲基化，而一些经长期培养的细胞系又会发生再甲基化。

植株再生过程中，甲基化能够抑制相关基因的表达，然而，甲基化／去甲基化在基因活性调控中的意义又会随生物的不同而不同。Brown (1989)发现，玉米体细胞无性系的某些再生植株与对照相比是超甲基化的，有些更容易被HpaⅡ割，这说明甲基化的趋势发生了改变，而且在玉米组织培养中，甲基化变化在基因组中的分布并不是随机的。Devaux等(1993)比较大麦由组织培养得到的双单倍体(DH)群体和由球茎大麦染色体消失法得到的DH群体的甲基化差异发现，由甲基化引起的限制性片段长度多态性(RFLP)变化96％来自于组织培养法的DH群体，说明组织培养能引起甲基化，甲基化对无性系变异起着重要作用。

(三)基因重排

基因重排是DNA分子内部核苷酸顺序的重新排列，在组织培养过程中有时发生，一般发生在细胞脱分化时期，这也是导致无性系变异的另外一个原因。Das (1990)在玉米栽培系‘A188’的培养细胞中发现，玉米储藏蛋白基因座位有高频率的基因重排现象发生，重排起源于DNA复制过程中的同源染色体重组和缺失、倒位和插入。

由于植物基因组比较大，研究基因重排困难，所以目前主要研究线粒体DNA (mtDNA)和叶绿体DNA (cpDNA)的重排。mtDNA和cpDNA具有很高的保守性，其中cpDNA的保守性更高，因而较少变异。组织培养技术可使mtDNA产生较大变异。对多种植物限制性片段分析发现，来自整体植株和培养细胞的mtDNA存在很大不同。Hartmann (1989)比较小麦幼胚愈伤组织继代1次和6次后获得的再生植株发现，后者mtDNA发生重排，且培养时间越长，再生植株mtDNA变异程度越大。对培养2年的油菜细胞mtDNA的研究发现也存在基因重排，至少有2个倒位和1个比较大的重复。在整体植株中具有1个11.3kb的线性mtDNA片段，但在培养细胞中未出现。对小麦花粉培养后的再生绿苗和白苗cpDNA限制性片段比较发现，白苗个体中的cpDNA出现大段缺失。

(四)DNA总量变化

DNA总量变化主要是通过基因扩增和基因丢失实现的。基因扩增是细胞内某些特定基因拷贝数专一性增加的现象，是细胞在短期内为满足某种需要而产生足够基因产物的一种调控手段；基因丢失是在细胞分化过程中通过丢失某些碱基序列而失去基因活性的现象。关于高等器官在分化或在环境胁迫下某些特定的基因拷贝数可以增加或减少的论点早已被证明。有研究表明，在正常组织培养条件下，植物基因组也会发生基因扩增和丢失现象。在抗性选择过程中，受选择剂抑制的某些合成酶基因也经常发生扩增，使合成酶水平相应提高，从而维持细胞的正常生长。例如，在草甘膦致死浓度(20umol/L)条件下筛选出的烟草抗性细胞系，其DNA与EPSPs (3-烯醇丙酮酸莽草酸盐-5-磷酸合成酶，草甘膦可抑制其活性)的cDNA杂交表明，细胞的耐受水平与EPSPs的mRNA稳定性间存在正相关，参与该酶合成的至少2个基因发生了扩增现象，从而导致细胞内EPSPs mRNA水平的增加，且基因扩增程度的大小随细胞耐受水平的提高而提高。

在水稻中，一些重复序列在组织培养中也有明显的选择性扩增，愈伤组织DNA重复序列与叶片相比，有5～70倍的拷贝数差异，而不同品种的叶片间差异只有2～3倍。在亚麻卫星DNA和小麦rDNA的研究中也观察到了类似现象。Wang等(1990)将从栽培稻及其悬浮培养物中提取的DNA转移到硝酸纤维素膜上，与同位素标记的DNA高度重复序列探针进行杂交，检测发现，在未分化培养细胞中的这些高度重复序列扩增到了75倍。另有研究表明，体细胞无性系变异中的核糖体DNA (rDNA)及其间隔序列和一些重复序列还很容易发生序列丢失。Brettell (1986)观察到小黑麦再生植株1R染色体上rDNA间隔序列减少了80％。在水稻愈伤组织或花药培养中也发现有大量DNA片段拷贝数减少或大片段叶绿体DNA丢失的现象。利用限制性酶切片段分析，野生大麦的第二代再生植株丢失了2.8kb和2.5kb的rDNA间隔区序列；长期培养的甜瓜愈伤组织细胞中的散置重复序列也大量减少。目前还不清楚在体细胞无性系中DNA序列减少对细胞脱分化、再分化及植株再生有何生物学意义。

(五)转座因子的激活

转座因子是引起体细胞无性系变异的又一重要原因。在组织培养过程中，由于细胞处于高速分裂状态，所以染色质复制出现滞后，导致细胞分裂后期形成染色体桥和染色体断裂。在断裂部位DNA修复过程中，属于异染色质的转座子会发生去甲基化而被激活，并发生转座作用从而引起一系列结构基因的活化、失活和位置变化，导致无性系变异的出现。转座因子根据转座机理不同可分为两类：第一类称为转座子，是经典遗传学上的转座因子，它们在转座酶的作用下从原位置解离，并整合到新位置而达到转座目的，如玉米中的Ac/Ds,Spm/En因子和金鱼草中的Tam因子等。第二类称为反转录因子，其转座过程是原位置DNA先转录成RNA，再经过反转录形成DNA并整合到新位置，但原有DNA并不离开原位置。

McClintock在自交玉米后代中首先发现了转座子，随后在玉米体细胞无性系再生植株中也检测到激活的转座子，且认为转座子激活可能起源于染色体断裂和重排及碱基的去甲基化，并提出碱基去甲基化可能是激活转座子(活性Ac)的一个结果，而不是原因。有研究表明，在组织培养过程中，玉米3个转座系统Ac,Spm和Mu均表现出活性。转座子一旦被激活，就可在基因组中的一个位点跳跃到另一个位点，其插入和解离将直接影响相邻基因的表达，因而导致基因组产生一系列明显变化。有人利用无Ac活性的玉米为材料，在组织培养的无性系再生植株中发现3％植株的Ac被激活，而对照的Ac未被激活；进一步研究Ac被激活的植株后代，分离到与Ac活性共分离的SstⅠ-30kb和BglⅡ-10kb两个Ac同源限制性片段，并认为其中包括经组织培养活化的Ac因子。

实际上，利用转座子来解释体细胞无性系变异现象，在很多方面比较吻合：①高等植物中存在多种转座因子系统，在组织培养中由于外源激素等因子诱导激活转座因子，从而造成有关基因表达的广泛变异，由此可以解释有些体细胞无性系变异不仪频率高、变异范围广，且致死突变频率低的原因；②转座因子具有使不活动基因活化或使活跃表达基因失活的特性，由此可以说明在体细胞无性系变异中，不仅有隐性基因被激活，也有显性基因被激活，表现出显性基因突变频率远高于物理化学因子诱发的变异率；③转座因子可诱发位于中度或高度重复序列的多拷贝基因中不表达的拷贝活化，提高这些基因的表达强度。因此，在体细胞无性系变异中，这类基因(如rDNA)表现出明显的基因扩增，同时rRNA表达量也增加，由此核糖体增加，从而为蛋白质合成提供了丰富场所，以适应离体培养中细胞分裂和分化的需要。