一、体细胞无性系变异的筛选

植物细胞在组织培养过程中会因多种因素的影响而产生变异，但为了增加突变频率，一般需要进行诱变处理。具体使用多大剂量和处理多长时间才能达到较好的诱变效果，则应根据具体试验材料而定。目前常用的筛选细胞突变体的方法包括以下几种。①肉眼观察法。对于那些色素异常或形态上有明显变异的细胞，直接采用肉眼观察进行选择。②正向选择法。通过添加不同的选择剂类型，利用正选择系统筛选出不同抗性水平的细胞。③负向选择法。对营养缺陷型的突变细胞，则可利用其生长不良的特性，采用负选择系统进行筛选。④分子标记选择法。利用分子标记，如RFLP, RAPD, AFLP, SSR, SCAR等进行突变细胞的选择。

如果采用正向选择法，还可考虑两种选择方案，即“一步筛选法”和“多步筛选法”。①一步筛选法。将培养物接种在含有最低致死剂量的培养基上，在该培养基上仍然生长良好的培养物再转移到含有抑制剂的新鲜培养基上进行培养。可见，这种方法的原则是首先设定一个高筛选压力，使不抗的细胞(如野生细胞)完全不可能生长，而在该压力下能够生长的细胞即为耐(抗)性细胞系。在使用该方法时，有时会出现细胞在超过最低致死浓度时全部死亡的现象，或有的细胞在单个状态下不能生存，因而使用范围有限。②多步筛选法。首先使用半致死剂量对细胞进行筛选，随后将上次生长良好的细胞系继续转移到筛选压力逐渐提高的新鲜培养基上。在这种筛选体制下，抗性细胞应该比野生型细胞的生长繁殖速率快。因此，通过逐步增加筛选剂浓度的方法，最终会筛选出在抑制剂超过最低致死浓度压力下也能旺盛生长的细胞系，并且很容易获得在某一抑制剂水平下稳定生长的细胞系。但是，这种方法也有一个问题，即去除抑制剂后抗性培养物的稳定性问题，分析其抗性丢失的原因可能有很多，其中包括细胞对抑制剂的生理适应。

需要注意的是，在进行突变体筛选之前，首先应确定所采用的抑制剂浓度，即利用多大剂量的筛选剂比较合适，所以需要做一个抑制剂量的实验。由于多数筛选是利用细胞悬浮培养进行的，故以悬浮培养为例来说明筛选压力的确定方法。具体做法是：每瓶接种一定重量的愈伤组织(如0.25g)，用不同浓度的抑制剂处理，培养一定时期(如10d)，收集培养细胞并称重，计算相对鲜重增长率：

式中，X_n是浓度为n的均重；X_c为对照均重；X_o为接种量。

根据上述计算结果作图，找出半致死剂量及使全部细胞致死的最低剂量，一般选择近于杀死全部细胞的剂量来进行突变体的筛选。

二、体细胞无性系变异的检测

(一)形态学检测

形态学检测是一种传统的检测方法，是实际育种工作中最直接、最简便的方法。某些变异在试管苗阶段(如叶、茎、根阶段)即能检测，有些性状则需要到大田条件下检测，如花序、穗数、株高等。Isareli (1991)在7个香蕉品种的体细胞无性系中发现了株高、异常叶、假茎颜色、宿存花序及果实开裂等形态学变异。

(二)细胞学检测

细胞学检测主要通过染色体形态配对分析对变异植株染色体数目和结构变异进行鉴定，常采用染色体压片法、去壁低渗法等。陈可咏等(1994)用EMS处理芦苇的胚性愈伤组织，诱导分化后获得能在10.0g/kg NaCl的MS培养基上生长的耐盐变异植株，经细胞学检查变异植株发现，染色体数目变异为33～100。Ahloowalia等(1985)发现，小麦体细胞无性系SC₄代再生植株的形态及产量均发生明显变异，经细胞学检测，无性系染色体数目发生变化，表现为非整倍体、多倍体和混倍体。但也有表型发生变异但染色体结构和数目并未发生变化的情况。

(三)同工酶酶谱分析检测

同工酶是由染色体上不同基因位点或同一位点等位基因编码的，是基因型的生理生化表现型，因此可在蛋白质水平检测无性系变异的存在。Ryan等(1987)在149株小麦幼胚愈伤组织再生植株中发现22株存在麦粒。α-淀粉酶的带型变化；Davies等(1986)在551株小麦再生植株中发现17株的Adh2酶谱发生变异。冯建荣等(2000)对3个草莓品种愈伤组织诱导苗的过氧化物酶同工酶变异情况进行分析，发现变异频率为10％～20％。另外，麦醇溶蛋白和谷蛋白也可作为标记来研究无性系变异，在变异植株中也多次检测到这两种酶谱的质量和数量变化。但是，有时也出现植株农艺性状改变而同工酶谱带未检测到变异的情况。究其原因可能有以下几点：①由于受环境和个体发育的影响，酶的变异稳定性差；②并非所有的氨基酸代换都能引起蛋白质分子电荷的改变，并非所有氨基酸的改变都能通过电泳检出。因此，利用同工酶技术检测突变体也存在一定局限性。

(四)分子生物学检测

分子生物学检测技术可直接对变异DNA进行分析，因而比其他方法更能直接反映无性系真实变异情况。常用分子生物学技术有：限制性片段长度多态性(restriction fragmentlength polymorphism, RFLP)、随机扩增多态性DNA (random amplified polymorphicDNA, RAPD)、简单重复序列(simple sequence repeat, SSR)等。

1. RFLP检测技术

RFLP可反映群体内同源DNA序列中核昔酸排列顺序的差异，因而从无性系的RFLP多态性变化可以反映真实变异的存在。如果采用特异识别甲基化碱基的限制性内切核酸酶，则对检测由于DNA甲基化状态改变而引起的体细胞无性系变异尤为有用。程备久等(1996)对马铃薯12个原生质体无性系采用RFLP分析发现，2个系的28S rDNA减少了70％，而其表型却未受到大的影响。Muller等(1990)利用5种探针分析水稻愈伤组织再生植株RFLP变化，愈伤组织培养67d的再生植株中有23％表现RFLP多态性，培养28d的有6.3％表现RFLP多态性，说明培养时间的延长可增加无性系变异。杨长登等(1996)采用分布于水稻12条染色体的121个RFLP探针对组织培养突变体‘黑珍米’及其供体亲本进行分析发现，24.8％的RFLP探针检测到了多态性，进一步研究表明有77.8％多态性是由点突变引起的。

2. RAPD检测技术

RAPD常用于检测模板DNA上引物同源序列间发生的片段插入、缺失及引物结合位点内的核昔酸变异。李继红等(1999)利用RAPD技术在60个随机引物中找到了4个可用于鉴定4个番茄品种体细胞无性系变异的引物。达克东等(2001)对苹果体细胞无性系变异进行了RAPD评估。表4-1为近年来RAPD方法分析体细胞无性系变异的一些结果。Jin等(2008)采用RAPD等标记对棉花体细胞克隆系及再生植株的变异检测结果表明，激素组合与变异有关。变异株系聚类分析表明，不同株系之间存在明显的遗传差异。

表4-1体细胞无性系变异的RAPD检测(李莉，2004)

3. SSR检测技术

SSR能够检测出因改变引物退火位置或重复次数而引起的体细胞无性系变异。将SSR引入组织培养体系，可准确快捷地鉴定离体培养下的各材料基因型，确定其遗传背景和来源。

但是，随着研究的深入，人们也发现利用分子标记检测体细胞无性系变异几乎没有规律可循。有些情况下，表型明显发生改变，却无法用分子标记检测出来；相反，表型正常的再生植株却检测到很多分子标记多态性。另外，分子标记变异率与细胞学特征之间也无联系。分析其原因可能与植物体基因组的巨大性及现行分子标记只能检测其中少数部分有关，这也是体细胞无性系变异复杂性的表现。