一、体细胞无性系变异的影响因素

(一)基因型

基因型不同，体细胞无性系变异频率不同，引起这种差异的原因可能与材料遗传背景及基因型对外界因素敏感程度有关。赵成章(1993)总结了不同作物的变异频率，小麦为15.4％、水稻为71.9％～75.8％、玉米为11.6％、甘蔗为18.0％、烟草为7.5％、马铃薯为100％。周朝鸿(1997)分析了3种百合再生植株体细胞染色体数量变异发现，淡黄花百合变异类型为三倍体和四倍体，百合变异类型为三倍体。朱秀英等(1990)对20个水稻品种成熟或未成熟胚无性系变异后代研究发现，品种间无性系变异频率不同，其中‘808’无性系变异的频率最高，而‘金早4号’无性系变异频率最低。

(二)外植体来源

外植体来源不同，对体细胞无性系变异影响不同。一般来说，距离器官分化生长中心越远，体细胞无性系变异频率就越高。果树组织培养研究发现，茎尖、腋芽等具有分生组织的外植体，其变异频率明显低于叶片、根段和茎段等未分化形成分生组织的外植体。当外植体来源于嵌合体时，嵌合体的分离就会导致高频率变异的出现。McPheeters和Skirvin(1983)研究发现，来源于有刺黑莓的无刺嵌合体，在组织培养后可获得半数短刺或无刺的再生植株。另外，外植体生理状态也会影响变异频率，伤口外植体比未受伤外植体的变异频率要高。倍性高或染色体数目较多的外植体发生变异的频率一般也较高。

(三)再生途径

在植物组织培养过程中，从外植体到分化成苗一般有两种再生途径，这两种途径的主要区别在于是否形成愈伤组织。第一种途径为间接成苗：外植体诱导愈伤组织，再由愈伤组织分化成苗。第二种途径为直接成苗：外植体不经愈伤组织诱导阶段而直接分化成苗。有研究表明，第一种途径由于经历了愈伤组织这一脱分化过程，增加了细胞染色体变异的概率，从而导致体细胞无性系变异产生的频率明显增加。第二种途径由于越过了愈伤组织阶段，因而无性系变异概率大大降低。

(四)培养基成分

培养基的选择是组织培养过程中的重要环节，培养基成分，尤其是生长调节剂的种类和含量会诱导植物材料发生不同程度的变异。当培养基中含有多种激素时，其变异率要大于仅使用一种激素的变异率。2,4-D常用于愈伤组织诱导，但含有2,4-D的培养基要比含IAA,NAA、激动素的培养基具有更强的诱变作用。李士生等(1990, 1991)对小麦愈伤组织染色体跟踪研究发现，AgNO₃,6-BA,高浓度2,4-D、蔗糖均可诱发愈伤组织姐妹染色单体发生交换，且2,4-D提高变异频率、AgN0₃降低变异频率，6-BA的影响虽然不明显，但高浓度6-BA可加大长期培养愈伤组织的超倍性体细胞频率。

(五)继代时间与次数

继代时间与次数是影响体细胞无性系变异的重要因素，继代次数越多，变异概率就越大；继代时间越长，变异概率就越高。陈秀铃等(2002)对继代培养12.5年的小麦愈伤组织染色体结构变异进行了研究，并与继代1.5～8.6年的愈伤组织进行比较发现，染色体结构变异类型发生了改变，并认为长期继代培养不仅能引起染色体数目和结构变异，同时也可导致基因消失或表达发生改变。Muller等(1990)利用RFLP研究不同培养时间对无性系变异的影响时发现，培养9周的愈伤组织再生植株RFLP多态性为23％，而培养4周的RFLP多态性为6.3％，说明长时间培养可增加体细胞无性系DNA的多态性。

(六)外部条件

有些外部条件影响体细胞变异。高明尉等(1992)指出，用0.258Ci/kg γ射线处理愈伤组织使小麦的变异频率从6％提高到25％，增加了4倍。赵成章(1988)用1.94Ci/kg γ射线照射水稻愈伤组织，使水稻再生植株后代(R₂)早熟株系变异频率由1.8％提高到8.0％，也增加了4倍。

二、体细胞无性系变异在植物育种中的应用

种质资源匮乏严重影响植物育种和农业生产的发展，科学家们一直期望通过各种手段来诱发创造自然基因库中没有的种质资源，为品种改良提供中间材料。体细胞无性系变异是一个变异广泛、稳定快、效率高的新途径，可为植物改良、代谢途径研究、基因突变位点分析提供研究资源，因而已成为细胞工程育种的重要组成部分(图4-2)。研究人员通过将外植体(如叶片、茎秆和种子等)在实验室通过无性繁殖发生变异，然后通过分化手段得到再生植株以获得发生变异的新品种。经过努力，我国在体细胞突变体筛选和利用方面达到了较高水平，已有一批农艺性状良好的品种(系)应用于杂交育种和生产中(表4-2)。

图4-2植物细胞工程育种技术

表4-2我国主要经济作物突变体育种成效

资料来源：李思经等，1995。

(一)农艺性状改良方面的应用

1．株高突变体的筛选与应用

株高是重要的农艺性状，过高易引起倒伏减产，过矮则由于不能充分利用光能而影响产量，株高改良一直是植物育种重点之一。黄道强等(2001)采用幼穗培养诱导愈伤组织，经两次继代获得无性系，其矮秆变异频率显著提高，变异体的株高降幅达10～15cm,郭秀平等(2002)以同源四倍体水稻为材料，通过花药培养得到新种质矮变体‘H2558'，该变异体株高30cm,茎粗、分糵穗粒数多、剑叶短宽、株型紧凑，可在育种中作为矮源加以利用。孙立华等(1994)利用半矮秆、广亲和、粳稻种质‘02428’进行组织培养，获得由隐性单基因控制的高秆突变体‘02428h'；若将该突变体的高秆基因导入半矮秆广亲和系，则有利于解决亚种间杂种植株太高的问题。刘选明等(2002)以水稻不育系株‘1S’幼穗和成熟胚为外植体，经组织培养获得愈伤组织，继代25d后转移到高浓度2,4-D培养基上，经分化培养获得绿苗，随后进行多代种植调查，得到了配合力强、受一对基因控制的矮秆新不育系材料。

2.生育期性状的改良

李文雄等(1996)研究表明，通过胚离体培养获得的无性系后代，多数表现的早熟性变异是可以遗传的。余毓君(1997)对小麦体细胞变异研究表明，抽穗期一般提早0.3～5.0d，具有获得优良突变体的可能。胡尚连等(1996)对普通小麦再生植株的25个单细胞无性系研究表明，后代分离到熟期提早的变异类型，且提早幅度较大(5～8d)，可稳定遗传。郑企成等(1991)对9个基因型的小麦体细胞无性系进行研究表明，各基因型实生苗的抽穗期相对比较集中，其中4个基因型SC₁代植株抽穗期变异较大，变幅为3个或4个等级；SC₂代植株抽穗期变异范围更大。黄道强等(2001)也发现在幼穗培养诱导愈伤的再生植株中，生育期提早的变异体较多，有些个体提早5～7d成熟。这些研究均表明体细胞无性系变异是作物早熟品种改良的有效途径。

3．产量性状的改良

胡尚连等(1997)对小麦单细胞培养研究表明，穗部性状变异范围较广，有利的变异类型在第4代稳定遗传，并可繁殖到第8代，有可能直接筛选出应用于生产的株系材料。李文雄等(1996)通过胚培养得到了穗粒重明显超过对照材料的小麦稳定株系。余毓君(1997)对小麦体细胞无性系变异的研究表明，变异体的穗部性状变优，平均穗长增加1.0cm左右，平均每穗的小穗数增加1.5～2.0个，平均单株穗数增加0.5～1.0个，表明组织培养诱导和筛选体细胞无性系变异是品种产量性状改良的一种重要手段。

4．育性性状突变体

在植物体细胞无性系变异研究中，也观察到有育性性状变异的情况。曾寒冰等(1996)对小麦未熟胚离体培养研究表明，后代变异表现在小抱子形成和发育过程，对成熟花粉粒进行观察时看到多种异常情况，如空瘪、小型及多萌发孔等类型。郑企成等(1991)研究表明，SC₁代单株育性变异很大，育性普遍下降，基因型间有一定差异，其中‘丰抗8号’、‘京花8号'和‘8425’分别出现3.8％, 5.3％和4.3％的全不育单株，可用于雄性不育系的选育。

5．优良恢复系突变体

范树国等(1999)用野败型不育系‘珍汕97A’的幼穗为外植体，获得了能恢复不育系育性的可恢复株，说明采用体细胞无性系变异来获得育性恢复突变体的方法可能对那些难以获得恢复系的不育系来说，是创造恢复源的一种有效途径。沈圣泉等(2003)对引进的中籼品系‘3027’进行⁶⁰ CO-γ射线诱变处理，然后结合幼穗培养技术，从诱发产生的变异后代中成功选育出了优异恢复系突变体‘R3027'，并配制出强优势杂交水稻新组合‘且优3027',该组合于2000年4月通过浙江省品种审定委员会审定，展现了良好的应用前景。

(二)品质改良方面的应用

l.蛋白质含量变异体

蛋白质含量是衡量籽粒营养品质的重要指标之一。胡尚连等(1996), Ryan等(1987)的研究表明，小麦体细胞无性系种子的蛋白质含量存在较大变异，出现了蛋白质含量显著高于亲本的无性系材料。朱至清等(1992)研究认为，体细胞无性系变异后代不但蛋白质含量发生变异，而且氨基酸含量也发生变异。王培等(1995)研究表明，从同一单倍体的幼穗、成熟胚、继代花药愈伤组织和种子植株幼穗获得的无性系，其早代蛋白质含量的变幅很大，并从单倍体幼穗无性系中获得了5个蛋白质含量提高的冬小麦新品系。刘锦红等(1997)对小麦体细胞无性系再生植株后代籽粒蛋白质含量进行分析表明，有的株系蛋白质含量在16％以上，显著超过未经培养的亲本，且后代可以遗传。

2．储藏蛋白变异体

醇溶蛋白和麦谷蛋白是小麦籽粒胚乳中的主要储藏蛋白，二者占种子蛋白质的80％以上，与小麦品质密切相关。小麦体细胞无性系醇溶蛋白和麦谷蛋白的变异，不仅为育种者提供了变异源，而且为无性系变异提供了分子水平上变异的证据。所出现的高分子质量和低分子质量蛋自质谱带(亚基)增加或缺失，尤其是高分子质量亚基发生变化，可应用在小麦品质改良中。张怀刚等(1995)在未加诱变剂的情况下，通过小麦幼胚、幼穗离体培养获得了4个HMW 2GS变异株。胡尚连等(1998)研究表明，小麦胚培无性系后代醇溶蛋白和麦谷蛋白的谱带发生了改变，变异类型丰富，且亲本和无性系间有很大差异，不同株系表现也不同。朱至清等(1992)研究表明，小麦单倍体花粉植株的幼穗培养再生植株后代麦谷蛋白电泳图一谱也发生了变异，既有某些新带的出现，又有谱带迁移率的变化。

3．氨基酸含量变异体

氨基酸代谢受末端产物的反馈抑制调控，因此，通过筛选对某种氨基酸的反馈抑制不敏感的突变体，就有可能获得体内该种氨基酸含量提高的材料。Carlson (1973)通过筛选抗甲硫氨酸类似物的烟草突变体发现，甲硫氨酸含量比对照高5倍，从而证明了这种可能性。有学者以不同植物为材料，分别进行抗缬氨酸、苏氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸与色氨酸等氨基酸类似物的筛选，经氨基酸含量分析表明，氨基酸含量可提高6～30倍，其中苏氨酸含量提高了75～100倍。以S-2-氨乙基半胱氨酸(AEC)为选择剂，从未经诱变的玉米单倍体胚性细胞团中也筛选到了抗lmmol/L AEC的胚性细胞团。罗士韦(1982)在进行烟草突变体筛选研究时，利用赖氨酸的类似物“氧化赖氨酸”作为选择剂，成功地获得了高赖氨酸烟草突变体。

到目前为止，利用细胞突变体改良作物品质，特别是提高作物的一种或几种氨基酸含量，取得了一些较为理想的结果，但是仍然存在一些困难和问题。①对植物体内的代谢过程及其调节过程了解甚少，用抗代谢物的方法选出的突变体并不一定能过量地合成所需的氨基酸。所以，如何有效地控制生物体内各代谢途径之间的动态平衡是首要解决的问题。②大多数研究中细胞水平的突变性状不能在再生植株和期望收获的器官中表达。③抗性细胞中游离氨基酸含量的提高，能否相应地提高蛋白质中这种氨基酸的含量尚需进一步研究。④过量合成氨基酸是否会给植物的生长发育带来不利的影响或有无不良的连锁突变性状发生。

(三)抗性改良方面的应用

1．抗病突变体的筛选

以病菌毒素或病菌毒素结构类似物为选择剂，已筛选出抗烟草野火病，抗马铃薯晚疫病，抗油菜黑胫病，抗甘蔗鞘枯病、斐济病和毛霉病，抗小麦根腐病菌毒素和镰刀毒素萎蔫酸，抗甜菜褐斑病，抗胡麻叶斑病，抗水稻白叶枯病，抗小麦赤霉病，抗番茄早疫病等的多种材料。郭丽娟等(1987)曾开展过诱发抗玉米小斑病突变体的研究，利用单倍体胚性无性系为材料，以小斑病菌产生的致病毒素为选择剂，在短期内诱发和筛选到了抗小斑病的突变体。周嘉平等(1990)进行了烟草抗黑胫病突变体的细胞筛选研究，建立了在细胞水平上筛选抗黑胫病突变体的技术体系。这些抗性植株中只有少数做过遗传学分析，证明其抗病性是可以遗传的。

另外，张献龙等(1994;1995;1998)、姚明镜等(1994;1995)也已成功筛选到抗枯萎病、黄萎病的棉花突变体，其再生植株在病圃中表现出较好的抗性。赵海岩等(2001)用水稻成熟胚、花药作外植体获得愈伤组织，在培养基上添加稻瘟病菌粗毒素提取液，随后将较强活力的愈伤组织转到含稻瘟病菌粗毒素提取液的分化培养基上，经田间接种和天然疫圃种植鉴定，获得了两个抗性提高的稳定品系‘辽农2号’和‘辽农7号’，其抗病性较原品种提高1～3个等级。高东迎等(2002)以感病杂交水稻恢复系‘明恢63’的成熟胚为外植体，利用离体筛选技术获得了抗自叶枯病细胞突变体HX-3，遗传分析表明由一对显性核基因控制，等位性检测是一个新的抗白叶枯病基因，为水稻抗病资源的创新提出了新思路。

2．抗除草剂突变体

近年来，采用离体培养的方法筛选抗除草剂突变体的研究较多，目前已得到烟草、胡萝卜、番茄、苜蓿,橙、油菜、玉米、棉花、小麦、大豆、白三叶草、南洋金花等植物的抗除草剂突变体。Chaleff等在含有毒莠定的培养基上培养烟草细胞，筛选出7个抗性细胞系，其中4个具有再生能力，并得到了种子，在自交后代中，抗性和敏感的分离比例为1:10对这4个抗性突变体分析表明，其中3个是由单一显性等位基因传递的，另1个是由单一半显性等位基因传递的。Anderson等(1986)从玉米体细胞无性系中筛选到一株耐咪唑啉酮类除草剂的突变体，该突变体对除草剂的耐性提高了100倍，再生植株及其后代在田间条件下对该类除草剂也具有较好的耐受性。

3．耐盐突变体

我国有盐碱地约3000万hm2，主要分布在西北、华北、东北内陆和东部滨海地区。因此，培育耐盐作物新品种，配合采取相应的栽培措施，是这些地区作物获得高产的关键。目前为止，筛选出的耐盐细胞系已超过20种，所获得的抗盐再生植株也表现出一定程度的抗性，特别是郑企成等筛选获得的小麦抗盐突变体，已在黄淮海地区进行了试种。郭岩等(1997)以水稻花药为材料，经EMS处理并以未处理为对照，在NaCl胁迫条件下筛选耐盐突变体，所获得的变异体耐盐性已稳定遗传13代，F₂代耐盐性呈3:1分离，表明受一个主效基因控制。米海莉等(2001)以小麦‘宁春4号’为材料进行组织培养，成熟胚在诱导培养基上产生胚性愈伤组织后，经0.5％的NaCl继代培养存活的愈伤组织再转入含有0.05％ NaCl分化培养基上，再生植株种子通过大田盐地(含盐量为0.3％～0.4％)种植，收获种子用盐水培养，15d后其幼苗生长量、植株相对含水量、叶绿素含量等生理指标均有明显差异，最终获得了耐盐突变体。一个重要的问题是，逐渐加大盐胁迫浓度，筛选获得的耐盐性材料多属生理适应性。因此，耐盐筛选压力必须达到足以抑制绝大多数细胞分裂和生长的程度，在含盐培养基上，正常细胞几乎不能生长、分裂。这样，高盐胁迫下筛选到的耐盐植株才是真正的耐盐突变体。但是，由于植物耐盐的生理生化背景非常复杂，对其抗性机制了解还很少，耐盐性可能是通过非专一性的机制实现的，从而增加了抗盐突变体筛选工作的难度。

4．抗旱突变体

节水农业的发展使培育抗干旱作物新品种成为当前育种的重要目标之一，而通过离体培养筛选抗旱突变体也成了一种育种方法。Handa等用聚乙二醇为选择剂，虽然选出了具耐旱性的番茄细胞系，但是细胞的耐旱特性逐渐丧失。Smith等用高粱愈伤组织作为筛选材料，得到了比对照植株耐热、耐干的再生植株和种子，解剖学观察表明，耐旱株系角质层的蜡质含量比对照植株要高，但其经济学性状明显降低。陈凌等(2010)采用EMS诱变结合体细胞无性系变异，筛选抗旱越橘(Vaccinium L.)突变体，最终得到了9株抗旱能力明显提高的变异材料。

5．抗寒突变体

前人曾对小麦、甘蔗、烟草、辣椒等植物愈伤组织或悬浮系进行耐寒性筛选，获得了不同程度的耐寒细胞系，但仅有烟草得到了再生植株，而其抗寒性无法通过有性繁殖进行传递，由其后代重新诱导的愈伤组织丧失了对低温的抗性。金润洲等(1996)将来自11个基因型幼穗的愈伤组织，在15℃下继代培养，在粳稻体细胞无性系中获得了大量可遗传的耐冷变异体；遗传力分析表明，变异体可以在R2代进行选择，这对耐冷育种具有重要参考价值。经过几年努力，获得耐冷性极强的体细胞无性系28份，可作为耐冷育种的新种质资源。茄子(Solanum melongena L.)是喜温作物，多数品种在环境温度低于5℃时就会表现明显的冷害症状，产量和品质显著下降。赵富宽等(2003)用花药低温胁迫培养获得了茄子细胞变异体，对抗冷植株进行RAPD扩增表明：抗冷变异株的扩增产物与对照存在多态性差异，证明诱导产生的抗冷性与植株DNA某些区域的微细变化有关，且抗冷变异株的有性繁殖一代仍表现出较强的抗性。

6.抗金属离子胁迫的突变体

酸性条件下，土壤中的铝、锰等金属和重金属离子会对植物发生毒害，在改良土壤的同时，培育耐金属离子胁迫新品种是提高酸性土壤作物产量的重要措施。已有实验证明，大麦和小麦的耐铝性受单基因控制。在此基础上，进行耐铝番茄细胞系和耐铝烟草、胡萝卜再生植株研究，结果发现，离体筛选的突变细胞系在耐铝性状上比较稳定，再生植株可将耐铝特性通过自交传递给子代。通过对大麦的花药和幼胚培养物进行耐铝突变体筛选，得到了能够适应酸铝土壤的耐铝再生植株。另外，有学者已筛选获得了抗M的番茄细胞系和水稻植株、抗铜的水稻细胞系和烟草植株、抗汞的矮牵牛细胞系和烟草植株。

尽管体细胞无性系变异在育种中已有应用，但仍存在一些缺点。①产生的变异多，变异类型复杂，并非所有的变异都可以稳定遗传，离体选择只对那些在离体培养和移栽到大田环境条件下都可以表现的性状的表型变异有效。②变异方向难以控制、预测困难、负向变异多，或有一个性状表现优良，但其他方面则呈现负向，且变异类型并非都是新的。③筛选出的突变性状随世代的增加，存在逐渐丧失的可能与趋势，一些抗性突变体的筛选与丰产性之间存在一定矛盾。④植物细胞群体和微生物相比，除原生质体外，难以像微生物那样获得完全是单细胞的群体；离体培养时的增殖速率也远低于微生物，且多次继代后，特别是经过相应胁迫因子的筛选后，很容易丧失分化能力。⑤无性系变异选择并非对所有作物都有效，可能更适合于营养繁殖作物。

今后，随着分子生物学技术的迅速发展，加强从分子水平上进一步深入研究植物体细胞无性系变异的遗传机制，探讨各影响因素的作用机理，将有利于对植物组织培养中的变异进行定向诱导和更有效地选择，使其在作物品种改良、新品种选育和种质资源创新中发挥更大的作用。