(一)分离原理

1．吸附系数

在液固色谱法中，固定相是固相吸附剂，它们是一些多孔性的微粒物质，如氧化铝、硅胶等。它们的表面存在着分散的吸附中心，溶质分子和流动相分子在吸附剂表面呈现的吸附活性中心上进行竞争吸附，便形成不同溶质在吸附剂表面的吸附、解吸平衡，这就是液固吸附色谱具有选择性分离能力的基础。

当溶质分子在吸附剂表面被吸附时，必然会置换已吸附在吸附剂表面的流动相分子，这种竞争吸附可用下式表示：

式中，X_m和X_s分别表示在流动相中和吸附在吸附剂表面上的溶质分子；M_m和M_s分别表示在流动相中和在吸附剂上被吸附的流动相分子；n表示被溶质分子取代的流动相分子的数目。

当达到吸附平衡时，其吸附系数(adsorption coefficient)为

K_a值的大小由溶质和吸附剂分子间相互作用的强弱决定。当用流动相洗脱时，随流动相分子吸附量的相对增加，会将溶质从吸附剂上置换下来，即从色谱柱上洗脱下来。

2．分配系数

在液液分配色谱中，固定液被机械吸附在惰性载体上，溶质分子依据它们在固定液和流动相中的溶解度，分别进入两相进行分配，当系统达到分配平衡时，分配系数(partition coefficient)为

式中，C_s和C_m分别为溶质在固定相和流动相中的浓度；k'为容量因子；V_m和V_s为色谱柱中流动相和固定相的体积；β为相比率。

液液色谱固定相由两部分组成，一部分是惰性载体，另一部分是涂渍在惰性载体上的固定液。

在液固色谱中使用的固体吸附剂，如全多孔球形或无定形微粒硅胶、全多孔氧化铝等皆可作为液液色谱固定相的惰性载体。要求其比表面积50～250m²/g，平均孔径10～50nm。载体的比表面积太大，会引起不可忽视的吸附效应，从而引起色谱峰峰形拖尾。

由于可用作固定液的有机化合物种类繁多，因此液液色谱法对多种样品都能提供良好的选择性。依据固定相和流动相的相对极性的不同液液色谱法可分为：正相液液色谱法—固定相的极性大于流动相的极性；反相液液色谱法—固定相的极性小于流动相的极性。

正相和反相液液色谱法都可用于分离同系物及含有不同官能团的多组分的混合物。

(二)固定相

1．液固吸附色谱固定相

液固吸附色谱法的固定相为固体吸附剂，常用的是碳酸钙、硅胶、三氧化二铝、氧化镁、活性炭等。尤其是硅胶，它在经典柱色谱和薄层色谱中已获广泛应用，在高效液相(柱)色谱中，使用了特制的全多孔微粒硅胶，它不仅可直接用作液固色谱法的固定相，还是液液色谱法和键合相色谱法固定相的主要基体材料。

液固吸附色谱法对具有中等分子量的油溶性样品(如油品、脂肪、芳烃等)可获最佳的分离，而对强极性或离子型样品，因有时会发生不可逆吸附，常不能获得满意的分离效果。液固色谱法对具有不同极性取代基的化合物或异构体混合物表现出较高的选择性，对同系物的分离能力较差。

液固色谱固定相可分为极性和非极性两大类。极性固定相主要为硅胶(酸性)，氧化镁、硅酸镁分子筛(碱性)等。非极性固定相为高强度多孔微粒活性炭，近来开始使用的5～10um的多孔石墨化炭黑，以及高交联度苯乙烯-二乙烯基苯共聚物的单分散多孔微球(5～10um)和碳多孔小球(TDX)。

(1)极性固定相在极性吸附剂中，硅胶和硅酸镁为酸性吸附剂(表面pH=5),氧化铝和氧化镁为碱性吸附剂(表面pH=10～12)。

至今在液固色谱法中最广泛应用的是极性固定相硅胶。在早期经典液相柱色谱中，通常使用粒径在100um以上的无定形硅胶颗粒，其传质速度慢、柱效低。20世纪60年代在高效液相色谱发展的初期，出现了薄壳型硅胶固定相，它是在直径30～40um的玻璃珠表面涂布一层1～2um厚的硅胶微粒层而制成的具有孔径均一、渗透性好、溶质扩散快的新型固定相，使液相色谱实现了高效和快速分离。但由于薄壳型固定相对样品的负载量低(<0.1mg/g), 20世纪70年代后迅速发展了全多孔微粒(2～10um)固定相。由于它们的粒度均匀、孔径均为，装填在5～10cm的短柱，就可实现对样品的高效、快速分离，2001年为进行生物大分子分析，引入了全新的表面多孔粒子，粒径5um，表面具有0.25um多孔薄层，2007年又研制了粒径2.7um，表面具有0.5um多孔薄层的表面多孔粒子。至今全多孔硅胶粒子(TPP)和表面多孔硅胶粒子(SPP)已成为高效液相色谱柱填料的主体，获得广泛应用。

现在经常使用的硅胶固定相，有全多孔粒子(TPP)、薄壳硅胶粒子(TLP)、非多孔硅胶粒子(NPP)和表面多孔硅胶粒子(SPP)，它们的不同结构的外观图示见图9-35。

最常用的硅胶吸附剂，其含水量对色谱分离性能有很大的影响。对于未经加热处理的硅胶，其表面游离型硅羟基皆被水分子覆盖，不呈现吸附活性。当将其在150～200℃以下加热，进行活化处理时，会除去一些水分子，使表面相邻的游离硅羟基之间形成氢键，而获得具有最强活性吸附中心的氢键型硅羟基，用于高效液固色谱的商品硅胶皆属于此种类型。若加热超过200℃，部分氢键型硅胶再脱水，就形成吸附性能很差的硅氧烷键型。对大孔硅胶上述活化处理过程是可逆的，对小孔硅胶此过程是不可逆的。若加热温度超过600℃，则硅胶表面皆成为硅氧烷键而失去吸附活性。

购置的商品硅胶吸附剂，表面皆为氢键型硅羟基，表现出很强的吸附活性，反而会引起化学吸附，造成色谱峰峰形拖尾，并延长吸附柱的再生时间。为消除此种不良影响，常向硅胶柱中加入少量极性改性剂。如用硅胶分离碱性样品时，若向流动相中加入少许碱性物质(如三乙胺)，就可减轻色谱峰的拖尾或永久性吸附。

图9-35不同结构硅胶的外观
(a)全VL硅胶(dp=2～10um, =5.100nm)；(b)薄壳硅胶(dp=40um，薄壳厚度d=1um, =2～50nm); (c)非多孔硅胶(dp=1～3um)；(d)5um表面多孔粒子；(e)2.7um表面多孔粒子