高效液相色谱仪和气相色谱仪一样，也属于结构比较复杂的分析仪器，液体流动相的柱前压力与流量的控制，梯度洗脱最佳实验条件的选择，是实验操作中的关键内容。

1．高效液相色谱仪的一般性能指标

(1)双柱塞往复式恒流泵

压力范围：常规HPLC 0～40MPa，压力脉动1％。

快速HPLC 0～60MPa，压力脉动0.5％。

超高效HPLC 0～150MPa，压力脉动0.1％～0.2％。

流量范围：0.01～10.00mL/min，流量精度≤0.3％。

使用pH范围：2.0～10.0(不锈钢材料)；1.0～13.0 (PEEK材料)。

配备低压梯度或高压梯度控制单元。

(2)柱恒温箱温度控制范围：室温+10～+80℃；温度控制精度±1℃。

(3)可变波长紫外吸收检测器光源：氘灯和钨灯；双光束。波长范围：190～650nm，波长精度±1 nm，光谱通带6～8nm。噪声：±1×10^-5AU(254nm)。漂移：±2×10^-5AU/h (254nm)。

流通池：①标准池5～10uL，光程5～10mm，耐压4 MPa;②高压池14uL，光程10mm，最大耐压40MPa;③微型池1uL，光程5mm，最大耐压4MPa。

(4)示差折光检测器光源：钨灯。折射率范围；1.31～1.44RIU，1.40～1.60RIU。

2．高效液相色谱仪的操作

(1)高效液相色谱仪应安装在有强力通风的实验室中，实验室的高处和低处应设置两个通风口，以利于低沸点和高沸点有机溶剂蒸气的排放，保证实验室工作人员的安全。

(2)准备好用作流动相的各种溶剂，经过滤(通过≤0.5um的滤膜)、脱气后，按比例配好置于储液罐中。梯度洗脱时，每种溶剂置于一个储液罐中，将溶剂过滤器插入储液罐底部。

(3)将选用的高效液相色谱柱安装在流路中，拧紧连接的柱接头。

(4)检查并连接好电路，将检测器输出信号线与数据处理系统连接好。

(5)打开高压输液泵电源开关，调节色谱柱后载液(流动相)流量达1.0mL/min。对内径4.6mm、柱长10～25cm色谱柱，填充5～10um填料，柱前压6～15 MPa，调节柱温至恒定。

(6)打开可变波长紫外吸收检测器电源，调节好检测波长，排除吸收池中的气泡，待检测器输出的基线稳定后，就可进行分析。

(7)若使用示差折光检测器，打开电源后，首先确定检测器温度，待恒温后，再选定待测的折射率间隔，待基线稳定后可进行分析。

(8)如欲进行梯度洗脱，可由梯度控制单元设定欲进行的梯度洗脱程序，进样后就可按梯度洗脱程序进行分析。

(9)分析结束后，继续用流动相清洗进样阀和检测器10～20min。

(10)依次关闭检测器、梯度洗脱装置、高压输液泵的电源。

3．高效液相色谱仪的维护

(1)储液罐储存的流动相都应预先经0.51um的滤膜过滤，脱气后才可使用。溶剂过滤器使用3～6个月后，出现阻塞可先经超声波振荡器清洗，若无效应及时更换。储液罐应定期清洗，尤其当使用磷酸盐缓冲溶液时，易产生絮状沉积物必须及时清除，否则易引起柱阻塞。

(2)高压输液泵使用的流动相必须经过过滤和脱气，使用中应注意柱前压是否稳定，若压力突然升高，表明管道过滤器或色谱柱头堵塞，应立即停用，待更换过滤片，清理色谱柱头堵塞后方可重新开启高压输液泵。当使用酸或碱缓冲溶液或腐蚀性溶剂后，应及时清洗，防止无机盐结垢，造成泵柱塞受到磨损或腐蚀。当往复式泵泵头的单向阀排液不畅通时，应拆开通向混合器的接头，用流动相冲洗出机械杂质，而不要轻易拆开单向阀导致泵无法工作。

(3)六通阀进样器进样阀转动手柄用力要适当；欲用于进样的样品最好经0.5um滤膜过滤后再用于进样；应使用平头注射器进样以保护阀体的密封垫；每次实验结束要冲洗进样阀，防止缓冲溶液中无机盐或腐蚀物质残留阀内。

(4)色谱柱在六通阀后加流路过滤器以阻挡来自样品和阀垫的微粒；在过滤器和分析柱间加上保护柱，以阻断进入分析柱的微粒杂质保护分析柱；色谱柱应在要求的pH值范围和柱温下使用；若柱前压突然升高，应及时更换柱头的0.5um不锈钢过滤垫；每次实验后应用流动相冲洗至基线平直以后再次使用。

(5)检测器每次使用时应及时排除流通池中的气泡，开机后待基线平直，再注入样品进行分析。

(6)仪器出现电路故障，应及时找生产厂家进行维修。

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