磺胺类药物(sulfonamides, SAs)是一类用于预防和治疗细菌感染性疾病的化学治疗药物，它与抗菌增效剂联合使用后，抗菌谱扩大、抗菌活性大大增强，可以从抑菌作用变为杀菌作用。因此，磺胺类药物被广泛应用于兽药临床、动物饲料添加剂、水产养殖等领域。但长期使用不仅会使病菌产生抗药性，而且食品中残留超标易对人类健康造成危害。目前，磺胺类药物残留的检测方法主要有微生物学法、免疫分析法和理化分析法等。GB 29694-2013规定的是高效液相色谱法，它适用于动物源食品中的磺胺醋酰、磺胺吡啶、磺胺甲基吡啶等多残留的检测。

(一)测定原理

样品中残留的磺胺类药物，经乙酸乙醋提取、正己烷脱脂、MCX柱净化后，用高效液相色谱-紫外检测法测定，外标法定量。

(二)主要试剂和设备

1．试剂

乙酸乙酯、乙腈、甲醇、甲酸为色谱纯，其他试剂均为分析纯试剂。磺胺醋酰、磺胺吡啶、磺胺甲基吡啶等标准品含量应≥99％。

MCX柱：60mg/3mL。或相当者。

0.1甲酸溶液：取甲酸1.0mL,用水溶解并稀释至1000 mL

0.1％甲酸乙腈溶液：取0.1％甲酸830mL，用乙腈溶解并稀释至1000mL。

洗脱液：取氨水5.0mL，用甲醇溶解并稀释至100.0mL。

50％甲醇乙腈溶液：取甲醇50.0mL，用乙腈溶液稀释至100.0mL。

100.0ug/mL磺胺类药物混合标准储备液：取磺胺类药物标准品各10.0mg，于100mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度。-20℃以下保存，有效期6个月。

10.0ug/mL磺胺类药物混合标准工作液：取100ug/mL磺胺类药物混合标准储备液5.0mL，于50mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度。-20℃以下保存，有效期6个月。

2. 仪器和设备

高效液相色谱仪，配紫外检测器或二极管阵列检测器。

旋转蒸发仪、氮吹仪、固相萃取装置。

(三)测定步骤

1．试料的制备

取适量新鲜或解冻待测样品，绞碎后均质。-20℃以下保存待测。取一空白样品，均质后添加适宜浓度的标准工作液，作为空白对照。

2．测定步骤

(1)提取 称取待测试料5.000g，于50mL聚四氟乙烯离心管中，加乙酸乙酯20.0mL，涡动2.0min, 4000r/min离心5.0min后将上清液移至100 mL鸡心瓶中，残渣中加乙酸乙酯20.0mL，重复提取一次，合并提取液。

(2)净化在鸡心瓶中加0.1mol/L盐酸溶液4.0mL，于40℃下旋转蒸发浓缩至体积少于3mL，转至10mL的离心管中。用0.1 mol/L盐酸溶液2.0mL洗鸡心瓶，转至同一离心管中。再用正己烷3.0mL洗鸡心瓶，将正己烷转至同一离心管中，涡旋混合30s后，3000r/min离心5 mm，弃正己烷。再次用正己烷3.0mL洗鸡心瓶，转到同一离心管中，涡旋混合30s后，3000r/min离心5 min，弃正己烷，取下层液备用。

MCX柱依次用甲醇2.0mL和0.1mol/L盐酸溶液2.0mL活化，取备用液过柱，控制流速1 mL/min。依次用0.1mol/L盐酸溶液1.0mL和50%甲醇乙腈溶液2.0mL淋洗，用洗脱液4.0mL洗脱，收集洗脱液，于40℃氮气吹干，加0.1％甲酸乙腈溶液1.0mL溶解残余物，滤膜过滤，供高效液相色谱测定。

3．标准曲线制备

精密量取10ug/mL磺胺类药物混合标准工作液用0.1％甲酸乙腈溶液稀释，分别配制成浓度为10、50、100、250、500、2500、5000ug/L的系列混合标准溶液。以测得的峰面积为纵坐标，对应的标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。求回归方程和相关系数。

4．测定

色谱柱：ODS-3C₁₈(250mm×4.5mm，粒径5 um)，或相当者；流动相：0.1％甲酸＋乙腈，梯度洗脱如表4-14所示；流速：1 mL/min；柱温：30℃；检测波长：270nm；进样体积：100uL。

取待测样品溶液和相应的空白对照，作单点或多点校准，按外标法，以峰面积计算。

表4-14 梯度洗脱

5．结果计算

被测物残留量的测定按下式计算：

式中X—样品中相应的磺胺类药物的残留量，ug/kg;

P—样品中相应的磺胺类药物浓度，ug/mL ;

V—溶解残余物所用0.1％甲酸乙腈溶液体积，mL ;

m—样品质量，g。

计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定后的算术平均值表示，保留三位有效数字。本方法对动物源食品中磺胺类药物残留量的检测限和定量限，肌肉分别为5 ug/kg和10ug/kg，内脏分别为12ug/kg和25ug/kg。

相关链接：牛乳和乳粉中土霉素、四环素等残留量的测定

文章来源：《食品质量与安全检测技术》

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