一、概述

(一)理化性质

黄曲霉毒素(AF)是一类含有二呋喃环和氧杂萘邻酮(香豆素)，化学结构和性质相似的化合物，在紫外光照射下可发出荧光。早期根据毒素在薄层板上产生荧光颜色不同，分为黄曲霉毒素B族(产生蓝色荧光)和G族(产生绿色荧光)。这种分类方法并不科学，但仍然沿用至今。黄曲霉毒素易溶于甲醇、三氯甲烷、苯、乙腈、二甲基甲酰胺等，难溶于水、乙醚、石油醚、正己烷等溶剂。在弱酸性和中性条件下稳定不易破坏，pH<3时开始分解；在碱性溶液中不稳定，当pH 9～10时，可迅速分解成几乎无毒的盐。黄曲霉毒素对光很稳定，在日光下照射24小时，仅有少部分分解。一般的烹调加工不会使其破坏，如黄曲霉毒素B, (AFB,)在268℃以上才发生裂解。对氧化剂如次氯酸盐、漂白粉、高锰酸钾、过氧化氢不稳定，氧化剂浓度越高，分解越快。

目前已有20多种黄曲霉毒素及其衍生物得到分离与鉴定。天然食品中最常检出的黄曲霉毒素有AFB₁、AFB₂、AFG₁、AFG₂、AFM₁。AFB₂、AFG₂由AFB₁、AFG₁加氢而成，AFM₁是AFB₁体内羟基化的产物。其中AFB₁是典型代表，毒性大、污染率高。AFB₁纯品为无色结晶，分子式为C₁₇H₁₂O₆，分子量312。常见黄曲霉毒素的结构式如图9-1。

图9-1 黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂、M₁、M₂结构示意图

(二)主要来源

黄曲霉(A.flavus)、寄生曲霉(A.parasiticus)是黄曲霉毒素主要的产毒菌种，其产毒能力因菌株不同而差异很大。产毒株在自然界的分布因地区不同而异，一般寒冷地区产毒株少，而湿热地区产毒株多、产毒量高。当粮食及其制品、花生、玉米等坚果类产品未及时晒干或储藏不当时，容易被黄曲霉或寄生曲霉污染而产生此类毒素，尤其是玉米、花生污染最严重。动物因食用被污染的饲料而在其内脏、血液、奶和奶制品等中检出黄曲霉毒素。天然食品中检出率较高的毒素有AFB₁、AFB₂、AFG₁、AFG₂，其中以AFB₁最常见。奶和奶制品中易检出AFM₁。

(三)毒性与危害

黄曲霉毒素属剧毒物质，是目前发现的最强化学致癌物之一，比二甲基亚硝胺诱发肝癌的能力高75倍，被世界卫生组织(WHO)的癌症研究机构定为I类致癌物。AFB₁毒性强，是氰化钾的10倍，是砒霜的68倍。AFB₁易引起慢性毒性和急性中毒，其毒作用部位主要为肝脏，表现为肝组织学变化、肝功能变化，最后导致肝癌的发生；也可引起其他部位的肿瘤，如胃癌、直肠癌等。

AFM₁和AFQ是AFB₁在动物体内经羟化反应生成的两种主要代谢产物，前者的毒性和致癌性与AFB₁相似，主要从动物的尿液和乳汁中排出，部分存留在肌肉中。因此，乳及其制品中AFM₁的食品安全问题应该得到重视。

(四)分析方法

目前测定食品中黄曲霉毒素方法较多。我国的标准分析方法为薄层色谱法(GB/T5009.23, GB 5009.24),酶联免疫吸附法(GB/T 5009.22)和高效液相色谱法(GB/T 5009.23,GB/T 18979)。其中高效液相色谱法高效、快速，可同时测定多种毒素；酶联免疫吸附法样品处理简单、操作方便，但影响因素多，易出现假阳性或假阴性；微柱筛选法利用黄曲霉毒素在365nm紫外光照射下呈蓝紫色荧光而进行比较，但此法不能分离黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂、结果为黄曲霉毒素总量，与酶联免疫吸附法一样，可用于大批量样品筛选。

二、薄层色谱法

1. 原理样品中黄曲霉毒素经甲醇-水溶液提取后，浓缩，苯-乙腈混合溶液定容，经薄层板分离后，在365nm紫外光下观察荧光，AFB₁、AFB₂产生蓝紫色荧光，AFG₁、AFG₂产生黄绿色荧光，根据荧光强度与标准比较定量。

2．分析步骤

(1)样品处理：样品分别经正己烷(或石油醚)、甲醇-水溶液(55+45)振荡提取，再用三氯甲烷反提取甲醇水层，将三氯甲烷层经装有无水硫酸钠的滤纸过滤，水浴挥干，冷却后，用苯-乙腈(98+2)混合液溶解残渣，作点样液。
含油脂高的样品可用甲醇水溶液重复提取3次，再用三氯甲烷提取甲醇水溶液中的黄曲霉毒素；含水多的样品可直接用三氯甲烷提取。

(2)测定：根据展开方式不同，分为单向展开法和双向展开法，本书介绍前者。

1)定性：在硅胶G薄层板上点4个点：①混合标准溶液最低检出量点；②样液点；③样液点上滴加混合标准溶液最低检出量点；④样液点上滴加混合标准溶液定位用点。先用乙醚预展开，再用丙酮-三氯甲烷(8+92)展开，取出晾干，在365nm紫外光下观察。根据第二点(样液点)是否阴性或阳性，判断第三点黄曲霉毒素最低检出量能否正常出现或只是起定位作用；第四点主要起定位作用。若第二点在AFB₁、AFB₂、AFG₁、AFG₂对应的位置都无荧光点，则试样中AFB₁、AFG₁含量低于5 ug/kg，AFB₂、AFG₂含量低于2.5ug/kg；若相应位置上有荧光点，需进一步做确证试验。

2)确证实验：AFB₁、AFG₁能与三氟乙酸(trifluoroacetic acid, TFA)反应生成相应的衍生物，而AFB₂、AFG₂无此类反应。方法是在薄层板上滴加标准混合溶液最低检出量点和样液点，并在此两点上各滴加1小滴TFA，反应一定时间后，吹干。在同一薄层板上再点相同的两点，作为标准和样液衍生物的空白对照。按照上述方法展开、观察。若产生与AFB₁、AFG₁标准点相同的衍生物，即可确定。AFB₂、AFG₂的确证采用苯-乙醇-水(46+35+19)展开，若标准点和样液点出现重叠，即可确定。

3)定量：样液中AFB₁、AFB₂、AFG₂、AFG₂荧光点的荧光强度与对应标准点的最低检出量的荧光强度一致，则试样中AFB₁、AFG₁含量为5ug/kg, AFB₂、AFG₂含量为2.5ug/kg;若样液中任何一种黄曲霉毒素的荧光强度比其最低检出量的强，则需稀释后定量，直至样液点荧光强度与最低检出量点的荧光强度一致为止。再根据稀释倍数计算样品中黄曲霉毒素的含量。

3．方法说明

(1)本方法适用于各种食品中AFB₁、AFG₁、AFB₂、AFG₂的测定。AFB₁、AFG₁最低检出量为0.0004ug，最低检出浓度为5ug/kg; AFB₂、AFG₂最低检出量为0.0002ug，最低检出浓度为2.5ug/kg；定位点用的混合液中每毫升相当于0.2ug的AFB₁、AFG₁，以及0.1ug的AFB₂、AFG₂。

(2) AFB₁、AFG₂与三氟乙酸反应的衍生物比移值为B₁>G₁。

(3)样品处理时，样品中油脂、色素等杂质进入正己烷层，而黄曲霉毒素和水溶性杂质留在甲醇水层二用三氯甲烷反提取时，由于黄曲霉毒素更易溶解于三氯甲烷，从而进入三氯甲烷层，杂质留在甲醇水层。用乙醚预展开，可以将杂质与黄曲霉毒素预先分开，减少黄曲霉毒素相应处的杂质干扰，提高方法的灵敏度。

文章来源：《食品理化检验》

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