三、酶联免疫分析法

1．原理酶标微孔板用已知抗原包被后，洗除未吸附的抗原，加入一定量抗体抗原反应液(抗体与待测样品提取液的混合液)，竞争孵育，在固相载体表面形成抗原抗体复合物：洗除多余抗体及游离的抗原抗体复合物，加入酶标记的第二抗体，与吸附在固体表面的抗原抗体复合物相结合，再加入酶的底物，在酶的催化作用下，底物被氧化，生成有色物质，根据样品的吸光度值，用标准曲线法计算样品中抗原(AFTB₁)的含量。

2．分析步骤

(1)样品处理：样品用甲醇-水(55+45)和石油醚提取，水浴挥干，残渣用一定量甲醇-磷酸盐缓冲溶液溶解、定量转移至试管中，静置备用。

对于脂肪含量低的大米、小米等样品，可以直接用三氯甲烷提取。

(2)测定：①包被微孔板：用AFB₁-牛血清白蛋白(BSA)结合物包被酶标微孔板，4℃过夜；②抗原抗体反应：将稀释后的AFB₁单克隆抗体(一抗)与相同体积不同浓度的AFB1标准溶液混合，4℃静置：用作标准系列溶液；按照相同方法，将AFB₁抗体与等体积的样品提取液混合，4℃静置，用作样品分析溶液；③封闭：用洗液洗涤包被好的酶标板后，用封闭液封闭；④测定：将封闭好的酶标板再次洗涤后，加入抗原抗体反应液，一定条件下，竞争孵育。未结合的抗体和游离的抗原抗体复合物被洗掉，向酶标板孔内加酶标二抗，孵育。加底物显色，硫酸终止反应。在酶标仪上，在490nm波长处测定各孔的吸光度值。

3．方法说明

(1) ELISA法需要严格控制测定条件，否则误差大，数据不可靠。本方法对AFB₁的检出限为0.01ug/kg。

(2)本方法是间接竞争ELISA法，因此，样品中AFB₁的含量越高，吸光度值越低。二抗根据一抗的来源选择，如一抗是鼠单抗，则二抗选择酶标记的羊抗鼠或兔抗鼠抗体。

四、高效液相色谱法

(一)多功能柱净化-柱前衍生高效液相色谱法

1．原理样品中的黄曲霉毒素经乙腈-水提取，过滤，滤液经多功能净化柱后，净化液中黄曲霉毒素用三氟乙酸衍生，C₁₈柱分离，荧光检测器检测，以保留时间定性，标准曲线法定量。

2．分析步骤

(1)样品处理：称取适量粉碎均匀的样品，加乙腈-水(86+14)溶液振荡提取，过滤，滤液供净化用。取一定量滤液加入多功能净化柱的玻璃管内，将多功能净化柱的填料管插入玻璃管中，并缓慢推动填料管，净化后的液体被收集到多功能净化柱的收集池中。

(2)衍生化反应：取净化液适量，在真空下或氮吹条件下吹干，正己烷溶解，用三氟乙酸在(40±1)℃烘箱中衍生。衍生后再次吹干，用乙腈-水(15+85)溶解，混匀，离心，上清液供测定用。标准系列溶液按同法衍生化处理。
(3)色谱参考条件：C₁₈色谱柱(125 mm×2.1mm, 5um)；柱温30℃；流动相为乙腈-水，梯度洗脱；流速为0.5ml/min；荧光检测器，λ_ex：360nm, λ_em：440nm。

3．方法说明多功能净化柱是一种内装有反相离子交换吸附剂的小柱，能吸附脂肪、蛋白质、色素和碳水化合物等干扰物质，从而达到净化的作用；提取液过多功能柱净化时，速度要慢，过快会引起杂质去除不完全。本方法检测黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂时，色谱出峰顺序为G₁、B₁、G₂、B₂。

(二)免疫亲和层析-高效液相色谱法

1．原理试样用甲醇-水提取后，用免疫亲和层析柱净化，以水或含吐温-20的磷酸盐缓冲液洗柱除去杂质，再用甲醇洗脱交联在柱上的黄曲霉毒素，洗脱液经高效液相色谱分离，柱后衍生后，荧光检测器检测，标准曲线法定量。

2.分析步骤

(1)样品处理：取适量试样加入氯化钠和甲醇-水(7+3)，高速搅拌提取，过滤，准确取一定量滤液，用水稀释，过玻璃纤维滤纸1～2次，滤液备用。酱油样品根据含水量选择加甲醇的量，食醋样品需用pH 7.0磷酸盐缓冲液稀释后，再加氯化钠提取。将免疫亲和柱与玻璃注射器相接，样品提取液注入玻璃注射器中，以水淋洗柱子2次，再用定量体积的甲醇洗脱，洗脱液供检测用。酱油、食醋样品提取液过柱后，需先用含0.1％吐温的磷酸盐缓冲液清洗，再用水淋洗。

(2)测定：柱后衍生和色谱参考条件为C₁₈色谱柱(150mm×4.6mm, 5um )；甲醇-水(45+55)作流动相，流速为0.8ml/min；柱后衍生化系统；0.05％碘溶液衍生，反应管温度70℃；荧光检测器：λ_ex: 365nm，λ_em：440nm。

3．方法说明色谱出峰顺序为AFG₂、AFG₁、AFB₂、AFB₁；若将甲醇洗脱下来的AFG₂、AFG₁、AFB₂、AFB₁衍生后，可用荧光光度法测定总黄曲霉毒素含量。

相关链接：黄曲霉毒素检验（一）

文章来源：《食品理化检验》

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