6 试样的制备与保存

6.1 试样的制备

取有代表性样品500g,绞碎后搅拌均匀，制成实验室样品。试样分为两份，置于样品盒中，密封，并做上标记。

6.2 试样保存

制备好的试样置于-18℃冰柜保存。

7 测定步骤

7.1 基质混合标准溶液的制备

7.1.1 试样的称取

称取5个阴性样品，每个样品为5g(精确到0.01g)，置于50 mL离心管中，分别加入不同量混合标准工作溶液(4.17)，使玉米赤霉醇、玉米赤霉酮和己烷雌酚的浓度为1.25 ng/mL、2.5 ng/mL、5.0ng/mL、12.5 ng/mL、25ng/mL；己烯雌酚和双烯雌酚的浓度为2.5 ng/mL、5.0 ng/mL、10ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL。再分别加入适量内标标准溶液(4.19)，使内标物浓度均为10 ng/mL。

7.1.2 提取

加入20 mL叔丁基甲基醚(4.1)，在10000r/min转速下高速均质(5.4)1min。3000r/min离心(5.7)5min，将上清液全部转移至另-50 mL具塞试管(5.9)中备用：离心管中的残渣置于通风橱中挥发30 min，加入15 mL乙酸盐缓冲液(4.4)。高速均质1min，3000r/min离心5 min，将上清液全部转移至另-25 mL具塞试管(5.9)中，并在氮气浓缩仪(5.5)上于40℃水浴中吹去残余叔丁基甲基醚后，加入80uL β-葡糖苷酸酶(4.15)混匀，于52℃烘箱中放置过夜：在此缓冲溶液中加入氢氧化钠溶液(4.6)将溶液pH值调至7，加入10 mL叔丁基甲基醚，充分混合，3000r/min离心2min。移取叔丁基甲基醚层与前述的叔丁基甲基醚提取液混合，在氮气浓缩仪上于40℃水浴中吹干。加入1 mL溶解液(4.12)，涡旋30 s溶解，待净化。

7.1.3 净化

把样液转入硅胶固相萃取柱(4.20)，流速为2 mL/min，在样品试管中加入3 mL淋洗液(4.13)，混合后过柱，流速为2 mL/min，用3 mL淋洗液以3 mL/min的速度淋洗．加入2 mL空气以4 mL/min的速度吹过硅胶柱。用6 mL洗脱液(4.14)洗脱，流速为2 mL min。加入2 mL空气以6 mL/min的速度吹过硅胶柱，收集洗脱液。将洗脱液在氮气浓缩仪上于40℃水浴中吹干，加入1 mL流动相，涡旋30 s溶解。溶液经滤膜(4.21)过滤后，供液相色谱-串联质谱测定。

7.2 试样溶液的制备

称取待测样品5g(精确到0.01g)于50 mL离心管中，加入内标标准工作溶液，使内标物含量均为2.0 ug/kg。按7.1.2和7.1.3操作。

7.3 空白基质溶液的制备

称取阴性样品5g(精确到0.01g)于50 mL棕色离心管中，按7.1.2和7.1.3操作。

7.4 测定

7.4.1 液相色谱条件

a) 色谱柱：ZORBAX Eclipse SB-C₈, 3.5 um,150 mm×4.6 mm或相当者；

b) 柱温：25℃；

c) 流动相：乙腈＋水(70+30)；

d) 流速：1.0mL/min；

e) 进样量：50 uL。

7.4.2 质谱条件

a) 离子化方式：大气压化学电离；

b) 扫描方式：负离子扫描；

c) 检测方式：多反应监测(MRM)；

d) 离子源温度：325℃；

e) 雾化气压力：0.1035 MPa;

f) 气帘气压力：0.0690 MPa;

g) 辅助气压力：0.2415 MPa;

h) 喷雾器电流：-5 uA;

i) 电喷雾电压：-4500V;

J) 定性离子对、定量离子对、碰撞气能量和去簇电压，见表1。

表1 五种激素及代谢物的定性离子对、定量离子对、碰撞气能量和去簇电压

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文章来源：《常用兽药残留量检测方法》

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