底物

dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系。dNTP溶液具有较强的酸性，使用时应以NaOH将值调至7．0～7．5，分装小管，于-20℃存放，过多的冻融会使dNTP产生降解。在PCR反应中，dNTP浓度应在20～200μmol／L，dNTP浓度过高可加快反应速度，同时还可增加碱基的错误掺入率和实验成本。反之，低浓度的dNTP会导致反应速率的下降，但可提高实验的精确性。4种dNTP在使用时必须以等物质的量浓度配制，以减少错配误差和提高使用效率。此外，由于dNTP可能与Mg²⁺结合，因此应注意Mg²⁺浓度和dNTP浓度之间的关系，而且大于200μmol／L的dNTP会增加Taq DNA聚合酶的错配率。如果dNTP的浓度达到1mmol／L，则会抑制Taq DNA聚合酶的活性。

PCR聚合酶

最早用于PCR反应的酶是Klenow酶。由于该酶对高温耐受性差，每次变性时绝大部分酶失活，所以每经过数个循环后则重新添加新酶，致使实验操作复杂化且增加实验成本。以后又分别使用T4DNA聚合酶和T7DNA聚合酶，均因其耐热性较差使得这两种酶在PCR反应中的应用受到限制。后来发现的Taq DNA聚合酶有很高的耐热性(经95℃持续高温仍不失括)，加酶一次可完成整个PCR反应。Taq DNA聚合酶是一种耐热的DNA聚合酶，92．5℃时半衰期至少是130min。在不同实验条件下，此酶的聚合酶活性为每秒35～100个碱基。在70℃延伸时，链的延伸速度每秒可达60个碱基。在100μL PCR反应液中，一般加Taq酶2．5 U，足以达到每分钟链延伸1000～4000个碱基。Taq酶除了聚合作用，还具有5’一3’外切酶活性，但缺乏3’一5’内切酶活性，因此不能纠正链延伸过程中核苷酸的错误掺人。估计每9000个碱基出现一次错误，而合成41000个核酸可能导致一次框码移位。由于错误掺入碱基有终止链延伸的倾向，这就使得发生了错误不会继续扩大。

在100μL反应体系中，一般所需TaqDNA聚合酶的用量为0．5～5U。根据扩增片段的长短及其复杂程度(G+C含量)不同而有所区别。使用Taq DNA聚合酶浓度过高，可引起非特异产物的扩增；浓度过低则合成产物量减少。不同厂家酶的定义及生产条件不一，可根据具体情况区别使用。