PCR反应中引物浓度一般为0．1～0．5μmol／L，引物浓度偏高会引起错配和非特异性产物扩增，且可增加形成二聚体的概率，这两者还由于竞争使用酶、dNTP和引物，这一切均会使DNA合成产率下降。

引物是待扩增片段两端的已知序列，它决定了PCR扩增产物的大小。引物是PCR特异性反应的关键，理想的引物应该有效地与靶序列杂交，而与出现在模板中的其他相关序列的杂交是可以忽略的。引物设计的目的是要达到两个目标，即理想的扩增特异性和扩增效率。正确的引物设计，可以遵循以下基本原则进行。

①引物长度：特异性一般通过引物长度和退火温度控制。寡核苷酸引物长度一般为15～30bp。这些寡核苷酸引物适于不含序列变异的、靶位确定的标准PCR。引物长度增加，能提高特异性，但是在退火时被引发的模板会减少，而降低反应效率。实际应用中最适延伸温度不要超过Taq DNA聚合酶的最适温度(74℃)，这样才能保证产物的特异性。

②引物扩增跨度：以200～500bp为宜，特定条件下可扩增至10kb的片段。

③G+C的合理含量：一对引物的G+C含量和Tm值应该协调，G+C含量以40％～60％为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。如含有50％的G+C各20个碱基的寡核苷酸链的丁。值大概在56～62℃范围内，这样可为有效退火提供足够热度，根据公式Tm=4(G+C)+2(A+T)，可估计引物Tm值，Tm。值最好接近72℃，使变性条件最佳(G+C即为G与C的碱基数之和)。

④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。

⑤引物3’端的碱基，特别是末端倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。

⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。

⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其他序列无明显同源性。扩增时每条引物的浓度0．1～1μmol或10～100μmol，以最低引物量所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。