1．基本原理

对羟基苯甲酸酯类在酸性溶液中用乙醚提取，可以从含有蛋白质、糖等水溶性食品成分中分离出来。在测定对羟基苯甲酸时，不能直接进样，因为它有两个极性基团，常造成峰形拖尾，故要用甲基化试剂对羟基苯甲酸甲酯化以后，再进行气相色谱测定。

2．试剂和仪器

氯化钠(一级试剂)、重氮甲烷试液(取2～3g N-亚硝基甲基脲于50mL比色管中，加20～30mL乙醚，比色管在通风橱中用冷水冷却，在冷却过程中逐渐地加入大约5mL 20%氢氧化钠溶液，轻轻盖塞，不断地振摇后，用吸管吸取乙醚层，加5～10粒粒状氢氧化钠作干燥剂)、N-亚硝基甲基脲、无水硫酸钠(一级试剂)。

具有氢离子火焰检测器的气相色谱仪、填充柱(60～80目经有机硅烷处理的硅藻土担体，涂以3％甲基硅氯烷SE-30，内径3mm，长2m玻璃柱)、载气(氯气)、分液漏斗、恒温水浴。

3．操作步骤

(1)标准溶液的制备 对羟基苯甲酸用水重结晶后，在五氧化二磷上减压干燥一昼夜，再于105℃下干燥1h，准确称取50mg，加丙酮溶成200mL，作为标准溶液(此液1mL含对羟基苯甲酸250μg)。准确量取标准溶液0、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL，加丙酮至5.0mL，再准确加入5mL重氮甲烷试液，放置30min以上，作为标准曲线用标准溶液(此液1mL各含对羟基苯甲酸0、25μg、50μg、75μg、100μg、125μg)。

(2)样品的制备 准确称取样品约10g，置于均质器的杯中，加10mL氯化钠饱和溶液，加10％硫酸液使之变为强酸性。再加乙醚70mL，外槽用冰水冷却均质器10min，分取乙醚层。水层再每次加入50mL乙醚，重复操作两次。合并乙醚层于分液漏斗中，加20mL 氯化钠饱和溶液，轻轻振摇后，弃去水层。乙醚层加入25mL4％氢氧化钠溶液，振摇，分取水层，再用25mL 4％氢氧化钠溶液提取一次，合并水层，在沸水浴上加热15min，冷却后用10％硫酸溶液酸化，加氯化钠饱和，用水定量移入分液漏斗中，加：30mL乙醚反复提取两次，合并全部乙醚层。加约5g无水硫酸钠，室温下放置30min，以浓缩器为接收器，用滤纸过滤，残渣以少量乙醚洗涤，洗液与滤液合并，减压浓缩至2～3mL，加入丙酮至5mL，准确加入5mL重氮甲烷试液，放置30min以上，作为样品溶液。

(3)标准曲线 准确量取标准曲线用的标准溶液5μL，注入气相色谱仪中，根据峰高绘制标准曲线。

(4)测定准确量取样品液5μL，注入气相色谱仪，根据峰高在标准曲线上的位置求出样品溶液中对羟基苯甲酸的浓度并计算其含量。

4．计算

对羟基苯甲酸含量(g/kg) =（C×10）/1000ω=c/100ω

式中，c为样品溶液中对羟基苯甲酸的浓度，μg/mL；10为样品溶液的终体积，mL，ω 训为样品的质量，g。

(二)对羟基苯甲酸乙酯含量的测定

1．试剂和仪器

氢氧化钠(40g／L溶液)、硫酸(0．5ml／L溶液)、溴百里香酚蓝指示剂(0.1％乙醇溶液)、氢氧化钠(4g／L溶液)、磷酸盐缓冲液(pH 6．5，称取0．68g无水磷酸二氢钾，精确至0.001g，加13．9mL4g／L氢氧化钠溶液，用水稀释至100mL，即可使用)。

2．操作步骤

称取2g预先在80℃干燥2h后的样品(精确至0．0002g)置于锥形瓶中，用50mL滴定 管加入40mL氢氧化钠溶液(40g／L)，缓缓加热至沸回流1h，冷至室温，加5滴溴百里香 酚蓝指示剂，用0.5mol／L硫酸标准溶液滴定。另取40mL磷酸缓冲液，加5滴溴百里香酚 蓝指示剂，作为终点颜色对照液。要求同时做空白试验。

3．计算

X=2c(V1─V2)×0.1662/m

式中，X为对羟基苯甲酸乙酯的质量分数；c为硫酸标准溶液的浓度，mol／L；V1为空白消耗硫酸标准溶液的体积，mL；V2为样品消耗硫酸标准溶液的体积，mL；m为样品的质量，g；0.1662为每毫摩尔对羟基苯甲酸乙酯的质量，g。

取其算术平均值为报告结果，平行测定两个结果之差不得大于0.2％。