6 分析步骤

6.1 试样处理

6.1.1 含淀粉的试样

称取混合均匀的固体试样约2.5g或液体试样约10g（精确到0.1mg）于三角瓶中，加入0.5g淀粉酶（4.12）,用30mL温水溶解。

6.1.2 不含淀粉的试样

称取混合均匀的固体试样约2.5g或液体试样约10g（精确到0.1mg）于三角瓶中，用30mL温水溶 解。

6.2 测定液的制备

向上述处理过的试样溶液中加入1g脂肪酶（4.13），于37℃±5℃恒温空气浴振荡器中振荡过夜， 使其充分酶解。取出酶解好的试样，加入2 mL氢氧化钠溶液（4.1）,用50mL乙醇（4.2）将溶液转 入250 mL的分液漏斗中，充分混匀［必要时加少量饱和氯化钠溶液（4.3）］。加入50 mL正己烷（4.4）。 充分振摇2 min,静置分层。放出下层水相于另一个250 mL分液漏斗中，留下有机相。向水相中再次 加入50 mL正己烷再次萃取。合并有机相。用适量蒸馏水洗有机相两次。将有机相通过无水硫酸钠（4.5） 脱水过滤到一个500mL的烧瓶中，在旋转蒸发器上于40℃±2℃下蒸发至近干。用正己烷（4.4）转移 残留物到一个10 mL试管中，置氮吹仪上于40℃±2℃下吹干，准确加入1mL正己烷（4.4）,充分 振荡溶解残留物。将试管放入冰箱中在0℃以下冷冻lh备用。

6.3 测定

6.3.1 色谱参考条件

色谱柱：C₁₈色谱柱，150mm×4.6mm, 5 um,或具同等性能的色谱柱；

锌还原柱：4.6mm×50mm ；

检测波长：激发波长为243 nm,发射波长为430nm；

流动相：甲醇(4.6)900mL,二氯甲烷(4.7)100mL,冰醋酸(4.8)0.3mL,氯化锌(4.9)1.5g,无水乙酸钠(4.10)0.5g,溶解后用0.45um滤膜过滤；

流速：1mL/min；

进样量：10uL。

6.3.2 维生素K1标准曲线绘制

分别准确吸取标准中间液(4.15.2)0.0mL,0.5mL,1.0mL,1.5mL,2.0mL,2.5mL加正己烷定容至25mL,此标准系列工作液维生素K₁浓度分别为0.00ug/mL,0.40ug/mL,0.80ug/mL,1.20ug/mL, 1.60ug/mL,2.00ug/mL。

将系列标准维生素K₁工作液分别注入高效液相色谱仪中，测定相应的峰面积或峰高，以峰面积或峰高为纵坐标，以标准测定液浓度为横坐标绘制标准曲线。

6.3.3 测定液的测定

将制备好的测定液(6.2)在暗处放至室温，于离心机中在3000转/分钟下离心5min,吸取上清液 注入高效液相色谱仪中，测定相应的峰面积或峰高。从标准曲线上查得试样 溶液中维生素K1的浓度或通过回归方程计算出试样溶液中维生素K₁的浓度(ug/mL)。

7 分析结果的表述

试样中维生素K₁的含量按式(1)计算：

式中：

X——维生素K₁的含量，单位为微克每百克(ug/l00g)；

C_i——试样溶液的浓度，单位为微克每毫升(ug/mL);

V_i——试样溶液的体积，单位为毫升(mL)；

m_i——试样的质量，单位为克(g)；

n——液稀释倍数。

以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留到小数点后一位。

8 精密度

在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。

9 其他

9.1 由于维生素K₁遇光易分解，整个操作应避光。

9.2 本标准检出限为1ug/100g。

文章来源：《食品安全国家标准汇编检验方法（一）》

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