6.4 试样管的制作

按表2顺序加入蒸镏水、试样和叶酸测定用培养基于试管中，表中每一编号需制作3管。

表2试样管的制作

6.5 灭菌

将标准曲线管和试样管121℃灭菌5 min,迅速冷却到室温（商品化培养基按标签说明进行灭菌）。

注：保证加热和冷却过程中条件均匀，灭菌管数过多或距离太近，在灭菌锅中都可产生不良影响。

6.6 接种

无菌条件下每管中均加入一滴（约50uL）菌悬液（6.1.4）,加盖，充分振荡混匀所有试管（标准 曲线未接种空白管S1除外）。

6.7 培养

6.7.1 酸度法：36℃±1℃培养72h。对每支试管进行目测检查，未接种管内培养液应是澄清的，标准曲线管和试样管中培养液的浊度应有梯度。未接种管中若出现混浊，则测定无效。

6.7.2 光密度法：在36℃±19,培养16h～24h。其他同6.7.1。

6.8 测定

6.8.1 酸度法

6.8.1.1 用10 mL水将未接种空白管S1和接种空白管S2的培养物转至三角烧瓶中，以溴麝香草酚蓝（4.19）作指示剂，或用pH计以pH 6.8 ± 0.2为滴定终点用氢氧化钠标准滴定溶液（4.18）滴定标准曲线未接种空白管S 1和接种空白管S2。记录下消耗的氢氧化钠标准滴定溶液体积。

注：如果接种空白滴定反应消耗的氢氧化钠标准滴定溶液体积数等于或高于未接种空白水平的1.5mL,则测定结果 无效。

6.8.1.2 用10 mL水将标准曲线管和试样管中的培养物转至三角烧瓶中，以溴麝香草酚蓝（4.19）作 指示剂，或用pH计以pH6.8±0.2为滴定终点用氢氧化钠标准滴定溶液（4.18.1）滴定标准曲线管和试 样管的培养物。记录下消耗的氢氧化钠标准滴定溶液体积。

注：通常标准曲线管S7消耗的0.1mol/L的氢氧化钠标准滴定溶液体积数在8mL～12mL之间。

6.8.2 光密度法

以接种空白管（表1中试管号S2）作对照，取出最高浓度标准曲线管S7,振荡5s,在波长550nm下读取光密度值，放回重新培养。2h后同等条件重新测该管的光密度，如果两次光密度的绝对差结果≤2%,则取出全部检验管测定标准溶液和试样的光密度。

6.9 标准曲线的绘制

以标准曲线管叶酸含量作横坐标，以消耗氢氧化钠标准滴定溶液的毫升数或光密度值为纵坐标绘制标准曲线。

6.10 试样管中叶酸含量的计算

按照13.8每个试样管测定的消耗氢氧化钠标准滴定溶液的毫升数或光密度值，从标准曲线中查得 对应的叶酸含量。每一编号的三个试样管应计算管中每毫升测定液叶酸的含量，并与其平均值相比较。 相对偏差小于15 %的试管为有效试管，无效试样管应舍去，有效试样管总数应大于所有试样管总数的 2/3。重新计算每一编号的有效试样管中每毫升测定液叶酸含量的平均值，以此平均值计算全部编号试 样管的总平均值Cx。

注：样品管中叶酸含量低于0.05ng,高于0.5ng的值应舍去。

7 分析结果的表述

试样中叶酸含量按式（3）计算：

式中：

X—试样中叶酸含量，单位为微克每百克（ug/100g）；

C_x—6.10中计算所得的总平均值，单位为纳克（ng）；

D—品在处理后的稀释因子；

EB—鸡胰腺空白管中叶酸含量，单位为纳克每毫升（ng/mL）；

m—样品的质量或体积，单位为克（g）。

以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。

8 精密度

在重复性条件下获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过算术平均值的10%。

9 其他

本标准检出限为2ug/100g。

文章来源：《食品安全国家标准汇编检验方法（一）》

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