6 分析步骤

6.1 测试菌液的制备

6.1.1 干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)ATCC 7469冻干菌粉转入乳酸杆菌肉汤培养基(4.9.2)中,36℃±1℃培养24h后，转接至乳酸杆菌琼脂培养基(4.9.1)试管中，再36℃±1℃培养24h。培养好的乳酸杆菌琼脂培养基(4.9.1)试管的培养物作为贮备菌种。

6.1.2 从贮备菌种培养基上分别转接到三个乳酸杆菌琼脂培养基(4.9.1)试管中，放入培养箱中36℃±1℃培养24h。每月转接一次，作为月接种管贮于冰箱中。每月定期从月接种管中重新接种3个转接管保 存新菌株。

6.1.3 从月接种的培养管中的一支再接种一支乳酸杆菌琼脂培养基(4.9.1)试管，36℃±1℃培养24h, 作为日接种管每日测定用。

6.1.4 从日接种管中接种一管乳酸杆菌肉汤培养基(4.9.2),36℃±1℃培养24h。在无菌条件下离 心该培养液10 min (2000转/分钟)，弃去上清液。用10mL生理盐水(4.2)振荡洗涤菌体，离心10 min(2000转/分钟)，弃去上清液，用10mL生理盐水(4.2)振荡清洗。如前离心操作，弃去上清液。再 加10mL生理盐水(4.2),混匀。吸1mL该菌悬液于10mL生理盐水(4.2)中，混匀制成测试菌液。 6.1.5以生理盐水(4.2)做对照，用分光光度计，于550nm波长下，测测试菌液(6.1.4)的光密度 值，此值应在60%～80%。

6.2 试样的制备

6.2.1 乳制品

称取2g(精确至0.0001g)试样(约含叶酸5ug)于100mL烧杯中，用25mL～30mL水复原样 品，转入100mL容量瓶中，用水定容至刻度，溶液中叶酸的质量浓度大约为0.05ng/mL。吸取1mL 该样液和1mL鸡胰腺(4.1)于一个180mm×15mm的带螺旋盖的试管中，充分混合。加18mL含抗坏血酸的磷酸缓冲液I(4.3.1),再加1mL甲苯(4.6)。同时制备±空白对照管，吸1mL蒸镏水和1mL 鸡胰腺(4.1)于空白管中，加18 mL含抗坏血酸的磷酸缓冲液I (4.3.1)及1mL甲苯(4.6)。在37℃下，样品管和空白管保温16h后，于100℃水浴加热5min。用磷酸盐缓冲液I (4.3.1)作适当稀释， 得到浓度约为0.1ng/mL的叶酸盐溶液。

若确定样品中强化叶酸与原生叶酸相比所占比例很大，则可以用1mL样液加19mL含抗坏血酸的 磷酸缓冲液I(4.3.1)于100℃水浴加热5 min,再用磷酸盐缓冲液I(4.3.1)稀释，得到浓度约为0.1ng/mL的叶酸盐溶液。

6.2.2 谷物及谷物制品

称取大约含1ug叶酸的试样于150mL三角烧瓶中。加20mL pH7.8磷酸缓冲溶液II(4.3.2),混匀后加50mL水和1.0 mL甲苯(4.6)。加盖后121℃ 15min灭菌，然后迅速冷却。加1mL木瓜蛋白 酶溶液(4.11),于36℃±1℃保温3h后100℃加热3 min,冷却。加1 mL a-淀粉酶溶液(4.12), 36℃±1℃保温2h后加4mL鸡胰腺(4.1),加盖，36℃±1℃保温16h后100℃加热3min,冷却。用1mol/L盐酸(4.15)调pH至4.5,用水稀释定容到100mL。过滤得到澄清滤液，然后吸取1mL澄清滤液用磷酸盐缓冲液III(4.3.3)定容至100mL,得到浓度约为0.1ng/mL的叶酸盐溶液。

若确定样品中强化叶酸与原生叶酸相比所占比例很大则可以直接在样品中加20 mL 0.05 mol/L含 抗坏血酸的磷酸缓冲液II(4.3.2)和50mL水，于121℃灭菌15 min,然后吸取1mL澄清滤液，再用0.05mol/L磷酸盐缓冲液III (4.3.3)稀释，得到浓度约为0.1ng/mL的叶酸盐溶液。

6.3 标准曲线管的制作

按表1顺序加入蒸镏水、标准工作液(4.14.3)(测定谷物及谷物制品的标准溶液用磷酸盐缓冲液IV(4.3.4)代替磷酸盐缓冲液I(4.3.1))和叶酸测定用培养基(4.9.3)于培养管中。表1中每一编号需制作3管。试管S2至S10中，相当叶酸含量为 0.00ng、0.05ng、0.10ng、0.15ng、0.20ng、0.25ng、0.30ng、0.40ng、0.50ng。

表1标准曲线管的制作

相关链接：婴幼儿食品和乳品中叶酸（叶酸盐活性）的测定（二）

文章来源：《食品安全国家标准汇编检验方法（一）》

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