1．油菜籽总DNA的提取

称取约10g油菜籽样品，在研钵中加入液氮碾磨至样品粉末颗粒约0.5mm左右大小，然后称取约40mg磨碎的样品转入1．5mL的Eppendorf管中，设计提取双实验。加入100μLDNA抽提缓冲液，混匀，注意不要使样品结块，再加入900μL DNA抽提缓冲液，振荡30s后，反复颠倒混合5min。10000g离心5min，取上清液700μL，加入5μLRNase A(2mg／mL)37℃保温30min。加入等体积的Tris饱和酚，上下反复颠倒混匀共10min。10000g离心5min，取上清液600μL，加人等体积的三氯甲烷，上下反复颠倒混匀共5min。10000g离心5min，取上清液500μL，加入等体积的异丙醇，轻轻混合3min。10000g离心10min，此时管底有白色沉淀，去上清液，加入70％乙醇1mL清洗1～3次。倒去70％乙醇，短暂离心用吸管尽可能除去乙醇洗液。低温冷冻干燥约2min，加50μL TE缓冲液(pH 8．0)，溶解DNA沉淀。油菜籽总DNA的提取也可用相应的市售DNA提取试剂盒提取。

2．PCR检测

(1)PCR反应体系 检测转基因油菜籽中内外源基因采用的PCR反应体系。反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整。每个反应体系应设置两个平行反应。

以转基因油菜籽作为阳性对照、非转基因油菜籽作为阴性对照，以加入重蒸水作为空白对照。

(2)PCR反应循环参数检测转基因油菜籽内外源基因的PCR反应循环参数为：95℃5min；94℃20s，引物的退火温度40s，72℃40s，40个循环；72℃，3min。引物的退火温度。PCR反应循环参数可根据基因扩增仪型号的不同进行适当调整。

(3)PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测将适量50×TAE稀释成1×TAE溶液，配制溴化乙锭含量为0．5μg／mL的2％琼脂糖凝胶。

取15μL PCR产物，加1．5μL10×上样缓冲液点样进行电泳，并加DNA分子标准点样以判断PCR产物的片段大小。电压大小根据电泳槽长度来确定，一般控制在3～5V／cm，电泳时间根据溴酚蓝的移动位置来确定，电泳检测结果用凝胶分析成像系统记录。

(4)结果判断

①油菜籽DNA提取液是否适合PCR扩增的判断用针对油菜籽内源参照基因PEP基因设计的引物(两对引物可选其一)对油菜籽DNA提取液进行PCR测试，阴性对照、阳性对照和待测样品都应被扩增出248bp或121bp的PCR产物。如未见有PCR扩增，则说明在DNA提取过程中未提取到可进行PCR测试的DNA，或DNA提取液中有抑制PCR反应的物质存在，应重新提取DNA，直到扩增出248bp或121bp的PCR产物。

②油菜籽中转基因成分的检测 在油菜籽样品中转基因成分的检测中，首先筛选检测CaMV35S、FMV35S、NOS、NPT 1I基因，如果这些基因的检测结果均为阴性则直接报告检测结果；如果这些基因的检测结果有一个或两个呈阳性，则应进一步检测外源目的基因COX(修饰)、CP4一EPSPS(修饰)、BAR、PAT、BARNASE、BARSTAR中的一个或几个基因予以确认为哪一性状的转基因油菜籽。对于PCR检测结果为阳性的样品，应进一步进行确证试验，然后报告检测结果。

(5)确证试验样品检测为阳性结果时需要用实时荧光PCR来确证。