5 试验方法

5.1 实验动物

5.1.1 动物选择

实验动物的选择应符合GB14922.1和GB14922.2的有关规定。健康成年雄性小鼠，周龄为7周～12周，试验开始时动物体重的差异不应超过平均体重的±20%。动物应随机分组，每组至少包括5只可用于分析的动物。如试验设有几个采样的时间点，则要求每个采样时间点都至少有5只能用于分析的动物。

5.1.2 动物准备

试验前动物在实验动物房至少应进行3d～5d环境适应和检疫观察。

5.1.3 动物饲养

实验动物饲养条件应符合GB14925、饮用水应符合GB5749、饲料应符合GB14924的有关规定。

5.2 受试物配制

应将受试物溶解或悬浮于合适的溶媒中。首选溶媒为水,不溶于水的受试物可使用植物油(如玉米油等)，不溶于水或油的受试物可使用羧甲基纤维素、淀粉等配成混悬液或糊状物。受试物应现用现配，有资料表明其溶液或混悬液储存稳定者除外。

5.3 剂量

5.3.1 对照组

每次试验均应设置相应的阴性(溶媒)和阳性对照，阴性对照组除不使用受试样品外,其他处理与受试物组一致。

阳性对照组应在精原细胞和精母细胞观察到高于背景的染色体畸变的增加。阳性对照组的染毒途径可不同于受试物的给予途径,可仅在一个时间点采样。常用的阳性对照物有环磷酰胺(40mg/kg体重,单次腹腔注射)或丝裂霉素C(1.5mg/kg体重～2mg/kg体重,单次腹腔注射)。

5.3.2 剂量及分组

受试物应设3个剂量组,最高剂量组原则上为动物出现中毒表现和(或)个别动物出现死亡的剂量，一般可取急性经口毒性LD₅₀的50%作为高剂量,按等比级数2～4向下设置中、低剂量,低剂量组不应表现出毒性。急性经口毒性试验无法得出LD₅₀时,高剂量组则按以下顺序：

a)10g/kg体重；

b)人的可能摄入量的100倍；

c)一次最大灌胃剂量进行设计,再下设中、低剂量组。

5.4 试验步骤和观察指标

5.4.1 实验动物的处理

5.4.1.1 精原细胞

经口灌胃给予受试物，一般为一次给予受试物。受试样品溶液一次给予的最大容量不应超过20mL/kg体重。如果给予的剂量较大,也可在1d内分两次给予受试物,其间隔时间最好为4h～6h。高剂量组应于末次给予受试物后的第24小时和第48小时处死动物采样，中低剂量组的动物均在末次给予受试物后24h处死动物采样。

5.4.1.2 精母细胞

灌胃给予受试物,每天一次,连续5d。受试样品溶液一次给予的最大容量不应超过20mL/kg体重。各组均于第一次给予受试物后的第12天～第14天将动物处死采样。

5.4.2 秋水仙素的使用

动物处死前3h～5h腹腔注射秋水仙素4mg/kg体重～6mg/kg体重(注射体积：10mL/kg体重～20mL/kg体重)。秋水仙素宜当天现用现配。

5.4.3 标本制备

5.4.3.1 取材

用颈椎脱臼法处死小鼠，打开腹腔,取出两侧睾丸，去净脂肪，于低渗液中洗去毛和血污，放入盛有适量1%柠檬酸三钠或0.4%氯化钾溶液的小平皿中。

5.4.3.2 低渗

5.4.3.2.1 精原细胞

以眼科镊撕开被膜,轻轻地分离曲细精管,加入1%柠檬酸三钠溶液10mL,用滴管吹打曲细精管,静止2min,使曲细精管下沉,将含有许多精子的上清液仔细吸去。留下的曲细精管重新用10mL 1%柠檬酸三钠处理10min。

5.4.3.2.2 精母细胞

以眼科镊撕开被膜,轻轻地分离曲细精管,加入1%柠檬酸三钠溶液10mL,用滴管吹打曲细精管,室温下静止20min。

5.4.3.3 固定

仔细吸尽上清液,加固定液10mL固定。第一次不超过15min,倒掉固定液后,再加入新的固定液固定20min以上。如在冰箱(0℃～4℃)过夜固定更好。

5.4.3.4 离心

吸尽固定液,加60%冰乙酸1mL～2mL,待大部分曲细精管软化完后,立即加入倍量的固定液,打匀、移入离心管，以1000r/min离心10min。

5.4.3.5 滴片

弃去大部分上清液，留下约0.5mL～1.0mL,充分打匀制成细胞混悬液,将细胞混悬液均匀地滴于冰水玻片上。每个样本制得2张～3张。空气干燥或微热烘干。

5.4.3.6 染色

用1：10Giemsa应用液染色10min(根据室温染色时间不同)，用蒸馏水冲洗、晾干。

相关链接：小鼠精原细胞或精母细胞染色体畸变试验（一）

文章来源：《食品安全国家标准汇编检验方法（二）》

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