5.3 剂量

5.3.1 分组

试验至少设3个受试物剂量组，1个阴性(溶媒)对照组,必要时增设未处理对照组。若试验结束做恢复期观察,对照和高剂量需增设卫星组。对照组除不给受试物外,其余处理均同受试物剂量组。

5.3.2 剂量设计

5.3.2.1 原则上高剂量应使部分动物出现比较明显的毒性反应,但不引起死亡;低剂量不宜出现任何观察到毒效应(相当于NOAEL),且高于人的实际接触水平；中剂量介于两者之间，可出现轻度的毒性效应，以得出LOAELO。一般递减剂量的组间距以2倍～4倍为宜,如受试物剂量总跨度过大，可加设剂量组。试验剂量的设计参考急性毒性LD₅₀剂量和人体实际摄入量进行。

5.3.2.2 能求出LD₅₀的受试物，以LD₅₀的10%～25%作为28天经口毒性试验的最高剂量组，此LD₅₀百分比的选择主要参考LD₅₀剂量-反应曲线的斜率。然后在此剂量下设几个剂量组，最低剂量组至少是人体预期摄入量的3倍。

5.3.2.3 求不出LD₅₀的受试物,试验剂量应尽可能涵盖人体预期摄入量100倍的剂量,在不影响动物摄食及营养平衡前提下应尽量提高高剂量组的剂量。对于人体拟摄入量较大的受试物，高剂量组亦可以按最大给予量设计。

5.4 试验步骤和观察指标

5.4.1 受试物给予

5.4.1.1 根据受试物的特性和试验目的,选择受试物掺入饲料、饮水或灌胃方式给予。若受试物影响动物适口性,应灌胃给予。受试物应连续给予28天。

5.4.1.2 受试物灌胃给予,要将受试物溶解或悬浮于合适的溶媒中，首选溶媒为水、不溶于水的受试物可使用植物油(如橄榄油、玉米油等)，不溶于水或油的受试物亦可使用羧甲基纤维素、淀粉等配成混悬液或糊状物等。受试物应现用现配,有资料表明其溶液或混悬液储存稳定者除外。应每日在同一时段灌胃1次,每周称体重2次,根据体重调整灌胃体积。灌胃体积一般不超过10mL/kg体重,如为水溶液时,最大灌胃体积大鼠可达20mL/kg体重，犬15mL/kg体重；如为油性液体，灌胃体积应不超过4mL/kg体重;各组灌胃体积一致°

5.4.1.3 受试物掺入饲料或饮水给予,要将受试物与饲料(或饮水)充分混匀并保证该受试物配制的稳定性和均一性，以不影响动物摄食、营养平街和饮水量为原则,受试物掺入饲料比例一般小于质量分数5%,若超过5%时(最大不应超过10%),调整对照组饲料营养素水平(若受试物无热量或营养成分,且添加比例大于5%时,对照组饲料应填充甲基纤维素等,掺入量等同高剂量),使其与受试物组饲料营养素水平保持一致，同时增设未处理对照组;亦可视受试物热量或营养成分的状况调整受试物剂量组饲料营养素水平,使其与对照组饲料营养素水平保持一致。受试物剂量单位是每千克体重所摄入受试物的毫克(或克)数，即mg/kg体重(或g/kg体重)，当受试物掺入饲料其剂量单位亦可表示为mg/kg(或g/kg)饲料,掺入饮水则表示为mg/mL水。受试物掺入饲料时,需将受试物剂量(mg/kg体重)按动物每100g体重的摄食量折算为受试物饲料浓度(mg/kg饲料)，一般28天经口毒性试验大鼠每日摄食量按体重10%折算。

5.4.2 一般临床观察

观察期限为28d,若设恢复期观察,动物应停止给予受试物后继续观察14d,以观察受试物毒性的可逆性、持续性和迟发效应。试验期间至少每天观察一次动物的一般临床表现,并记录动物出现中毒的体征、程度和持续时间及死亡情况。观察内容包括被毛、皮肤、眼、黏膜、分泌物、排泄物、呼吸系统、神经系统、自主活动(如：流泪、竖毛反应、瞳孔大小、异常呼吸)及行为表现(如：步态、姿势、对处理的反应、有无强直性或阵挛性活动、刻板反应、反常行为等)。对体质弱的动物应隔离，濒死和死亡动物应及时解剖。

5.4.3 体重和摄食及饮水消耗量

每周记录体重、摄食量,计算食物利用率;试验结束时,计算动物体重增长量、总摄食量、总食物利用率。受试物经饮水给予,应每日记录饮水量。如受试物经掺入饲料或饮水给予,应计算和报告受试物各剂量组实际摄入剂量。

5.4.4 眼部检查

试验前和试验结束时,至少对高剂量组和对照组实验动物进行眼部(角膜、球结膜、虹膜)检查,犬用荧光素钠进行检查,若发现高剂量组动物有眼部变化,则应对所有动物进行检查。

相关链接：28天经口毒性试验（一）

文章来源：《食品安全国家标准汇编检验方法（二）》

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