［检测原理］

将已知抗原吸附在固态载体表面,洗除未吸附抗原,加入一定量抗体与待测样品(含有抗原)提取液的混合液,竞争培养后,在固相载体表面形成抗原抗体复合 物。洗除多余抗体成分,然后加入酶标记的抗球蛋白的第二抗体结合物,与吸附在 固体表面的抗原抗体复合物相结合,再加入酶的底物。在酶的催化作用下,底物发 生降解反应,产生有色物质,通过酶标检测仪测出酶底物的降解量,从而推知被测 样品中的抗原量。

［仪器与试剂］

仪器:微孔板、恒温培育箱、酶标仪、涡流振荡器。

试剂：

(1)四甲基联苯胺、30%过氧化氢、牛血清白蛋白(BSA)、吐温-20等。

(2)抗体 抗黄曲霉毒素B1的特异性单克隆抗体(或抗血清)。

(3)包被抗原黄曲霉毒素B1与载体蛋白(BSA或多聚赖氨酸等)的结合物。

(4)酶标二抗羊抗鼠免疫球蛋白G与辣根过氧化酶结合物。

(5)缓冲液系统 包被缓冲液为pH9.6的磷酸盐缓冲液;洗液为含0.05%吐 温-20的pH7.4的磷酸-柠檬酸缓冲液;底物缓冲液为pH5. 0的磷酸盐缓冲液； 终止液为1moI/L的硫酸。

(6)黄曲霉毒素B1的标准溶液 用甲醇配成1mg/mL的黄曲霉毒素B1储备液， -20℃冰箱贮存,于检测当天,准确吸取储备液,用20%甲醇的PBS稀释成制备标准 曲线的所需浓度。

(7)底物溶液10mg四甲基联苯胺于1mL二甲基甲酰胺中，取75uL四甲基 联苯胺溶液,加入10mL底物缓冲液,加入10μL 30%过氧化氢溶液。

［操作方法］

(1)样品处理 称取10g粉碎的样品于锥形瓶中，用50mL乙腈-水(50% + 50% ,体积分数)，用2mol∕L碳酸盐缓冲液调PH至8. 0进行提取,振摇30min后， 滤纸过滤,滤液用0∙1% BSA的洗液稀释后,供实验备用。

(2)测定用包被抗原(包被缓冲液稀释至10μg∕mL)包被酶标微孔板,每孔 100ul,4℃过夜。

(3)酶标微孔板用洗液洗3次,每次3min,每孔加50uL系列黄曲霉毒素B1的 标准溶液及50μL样品提取液,然后再加入50μL稀释后抗体,37℃培养1.5h。

(4)酶标微孔板用洗液洗3次,每次3min,每孔加100uL酶标二抗,37℃培 养2h。

(5)酶标微孔板用洗液洗3次,每孔加100uL底物溶液372培养0. 5h,用 1moI/L的硫酸终止反应。

［结果判定］

计算：

学习单元二米面类制品的快速检测

式中m'——酶标微孔板上所测得的黄曲霉毒素的量,ng（根据标准曲线求得）；

v₁ ——样品提取液的体积,mL ；

v₂——滴加样液的体积,mL;

d——样液的总稀释倍数；

m一样品质量,g。

文章来源：《食品快速检测实训教程》

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