把小鼠表达转甲基酶蛋白的基因敲除掉，做成细胞系ES或MEF细胞，这些细胞就没有特异的酶反应。这些细胞反应物让我们快速知道，我们感兴趣的底物在甲基化反应中是不是必需，以及反应的特异性如何。这将用到GST融合蛋白技术。这些底物被固定到琼脂糖珠子上，体外的甲基化试验就用细胞裂解液作为酶，使氖标记的甲基从AdoMet转移到GST融合蛋白上。这里我们用的底物是PABP1 (PRMT4的底物）和NP13 (PRMT1/HMT1的底物）。Prmt4＋／＋和Prmt4-／-MEF的细胞系作为酶的来源。

(1) 按照3.1中讲述的方法纯化底物，在第12步停下来，不用洗脱液洗珠子。

(2）用预冷的PBS洗包被在珠子上的底物。

(3) 将珠子用SDS-PAGE，考马斯亮蓝染色定量，分别上1 μg、2 μg和10μg的BSA作为参照。

(4) 将对数生长期的MEFs接种到10cm的培养平皿里，至密度达80%。

(5）用预冷的 PBS洗一次。

(6）加500 μ1预冷的PBS。

(7）用塑料细胞刮子把细胞从培养皿上刮下。

（8）把液体收到1. 5m1 epyendoof管里。

(9）超声l0s破碎细胞，超0.5s间隔0. 5s。

（10) 4℃10000g离心l0min。

(11）将上清移入一个干净的1. 5 ml epyendoof管中（300μl），再加入1 μg步骤3中的琼脂糖珠子（大约20μl）。

(12）加入3 μl S-腺苷L-［甲基-3H］甲硫氨酸。

（13) 30℃颠倒混匀2h。

(14）用预冷的PBS洗琼脂糖珠子3次。

(15）加入30μl×蛋白上样缓冲液，95℃加热5 min。

(16）将甲基化的底物进行SDS - PAGE，用Tris-甘氨酸缓冲液100V电泳l h。

(17）用半干转印法，将分离的样品转印到PVDF膜上。

(18）将EN 3HANCE喷在固定有蛋白的PVDF膜上3次，每次操作间隔l0min。

（19）将PVDF膜晾30分钟至完全晾干，放置在X胶片上过夜。