由于高效液相色谱中流动相是液体，它对组分有亲和力，并参与固定相对组分的竞争。因此，正确选择流动相直接影响组分的分离度。对流动相溶剂的要求是：

①溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良好的选择性，即适宜的溶解度。否则在柱头易产生部分沉淀。

②溶剂要与检测器匹配。对于紫外吸收检测器，应注意选用检测器波长溶剂的紫外截止波长要长。所谓溶剂的紫外截止波长指当小于截止波长的辐射通过溶剂时，溶剂对此辐射产生强烈吸收，此时溶剂被看作是光学不透明的，它严重干扰组分的吸收测量。可以搜索一下溶剂的紫外截止波长。如乙腈其紫外截止波长约为190nm，甲醇的紫外截止波长为205nm。对于折光率检测器，要求选择与组分折光率有较大差别的溶剂作流动相，以达最高灵敏度。

③高纯度。由于高效液相灵敏度高，对流动相溶剂的纯度要求也高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生“伪峰”。痕量杂质的存在，将使截止波长值增加50-100nm。

④化学稳定性好。不能选与样品发生反应或聚合的溶剂。

⑤低黏度。若使用高黏度溶剂，势必增高压力，不利于分离。常用的低黏度溶剂有甲醇、丙酮、乙醇、乙酯等，乙腈、甲醇是首选。但赫度过于低的溶剂也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它们易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离。

众所周知，液相色谱的溶剂系统可分为正相溶剂和反相溶剂两大类。液相色谱中，根据流动相和固定相的相对极性分为正相色谱（normal-phasechromatog-raphy）和反相色谱（reversed-phasechromatography)。在经典液相色谱中，固定相大都是极性较大的填料，如硅胶、氧化铝等，而流动相都是氯仿、正己烷等非极性溶剂；这种流动相极性小于固定相的洗脱方式，称为正相洗脱。若固定相是非极性的，流动相用醇、水等极性溶剂，则称为反相洗脱。在正相色谱中，极性最小的物质最先被洗脱，流动相极性增加，洗脱时间减少；而在反相色谱中，极性最大的物质先被洗脱，流动相极性增加，洗脱时间延长。目前有超过70%。
的高效液相色谱应用反相洗脱方式。

在选用溶剂时，溶剂的极性显然仍为重要的依据。为了获得合适的溶剂极性（强度），常采用二元或多元组合的溶剂系统作为流动相。常用溶剂的极性顺序排列如下。

水（极性最大），甲酰胺，乙腈，甲醇，乙醇，丙醇，丙酮，二氧六环，四氢呋喃，甲乙酮，正丁醇，醋酸乙酯，乙醚，异丙醚，二氯甲烷，氯仿，溴乙烷，苯，氯丙烷，甲苯，四氯化碳，二硫化碳，环己烷，己烷，庚烷，煤油（极性最小）。

在正相色谱中，最常采用的低极性溶剂为正己烷或正庚烷，为了获得合适的选择性和洗脱强度，在其中加入弱极性的二氯甲烷、氯仿、甲基叔丁基醚、异丙醇等。在反相色谱中，通常以极性最强、而洗脱能力最弱的水为流动相的主体，加入不同配比的有机溶剂作极性调节剂，常用的有机溶剂是甲醇、乙腈、四氢呋喃等。例如在正相液一液色谱中，可先选中等极性的溶剂为流动相，若组分的保留时间太短，表示溶剂的极性太大，改用极性较弱的溶剂，若组分保留时间太长，则再选极性在上述两种溶剂之间的溶剂。如此多次实验，以选得最适宜的溶剂。

采用反相色谱法分离强极性化合物或弱解离化合物（弱酸、弱碱）时，由于这些化合物在随流动相运行的过程中不断发生解离，并以离子和分子两种形态存在，离子在非极性的十八烷基键合相中分配系数很小，而分子的分配系数较大，因此出现不对称的色谱峰甚至分叉峰。此时，需在流动相中添加少量的酸、碱或一定pH的缓冲盐，以抑制这些化合物在分离过程中的电离行为，避免出现不对称的色谱峰，增大保留时间。

而对于强有机酸、碱的分析，上述添加剂已无法抑制它们的解离，此时可采用反相离子对色谱法。离子对色谱法是将一种（或多种）与溶质分子电荷相反的离子（称为对离子或反离子）加到流动相中，使其与溶质离子结合形成疏水型离子对化合物，离子对的保留行为与中性化合物类似，从而使溶质离子得到分离。用于阴离子分离的对离子如氢氧化四丁基铵、氢氧化十六烷基三甲按等；用于阳离子的对离子有十二烷基磺酸钠、己烷磺酸钠等。离子对色谱法通常采用化学键合固定相，根据离子对的分配系数的差异实现分离，因此也是一种化学键合相色谱法。