高效毛细管电泳（highperformancecapillaryelectrophoresis,HPCE）是20世纪80年代发展起来的经典电泳技术和现代微柱分离相结合的一项分析新技术。它分离模式多、适用范围广、速度快、分离效率高、所需样品和试剂少，已广泛用于黄酮类化合物的分离分析，并逐渐成为测定植物雌激素的常规方法之一。考虑到愈伤组织材料的成分复杂以及HPLC成本高，时间长，因此有必要对大豆异黄酮检测方法进行进一步研究，以建立起更加简便、有效、经济的检测方法。为了改进测定大豆异黄酮含量的HPCE方法，实验中分别考察了缓冲溶液组成、浓度和pH，内标物的种类，甲醇的添加量，分离电压对6种大豆异黄酮组分分离行为的影响，以期确立大豆异黄酮最佳的HPCE分离条件，同时通过与HPLC方法进行比较，探讨该方法的适用性，从而为分析检测大豆籽粒及愈伤组织中异黄酮成分含量提供一种较为理想的方法。

1．标准品和内标物溶液的准备

精确称取染料木苷、染料木黄酮、黄豆苷、黄豆苷元、黄豆黄苷、黄豆黄素、标准品各10mg，用色谱甲醇溶解，完全溶解后定容到100mL容量瓶中，然后储藏到4℃冰箱中备用。精确称取芦丁，懈皮素和鹰嘴豆芽素A各10mg，用色谱甲醇溶解，完全溶解后定容到100mL容量瓶中，再将三种内标物溶液稀释为20μg/mL的浓度。储藏到4℃冰箱中备用。

2.大豆籽粒和愈伤组织样品溶液的制备

大豆籽粒经粉碎机磨成细粉后混匀，过60目筛。取出新鲜的大豆愈伤组织放在60℃烘箱中烘干至恒重，然后用研钵磨成细粉后混匀。样品提取采用温和水解法。分别准确称取大豆籽粒和愈伤组织干粉0.2g，置于l0mL聚四氟乙烯离心管中，加7mL80％乙醇，60℃超声波振荡提取lh，然后80℃恒温水浴6h,4000r/min离心l0min，倒出上清液，再加入2mL80％乙醇，振荡，4000r/min离心10min，倒出上清液合并滤液定容至l0mL，吸取1mL上清液于14000r/min离心10min，吸取500μL上清液到lmL小离心管中，保存于4℃冰箱中。分析前吸取200μL样品溶液和50μL内标物溶液到0.6mL的毛细管专用小管中，混匀后进样检测。

3.HPCE实验条件

用NaOH和H3BO3调节硼酸盐电泳缓冲液Na2B4O7的pH。毛细管柱使用前用0.5mol/L的NaOH溶液浸泡一夜，然后用超纯水洗至中性，最后用电泳缓冲液冲洗并且平衡10min。压力进样20s，在25±1℃、16.5kV恒压下进行电泳分离，并在254nm波长处检测。每两个样品运行之间，用电泳缓冲液冲洗毛细管柱2min，分析10个样品后更换缓冲溶液。

4．测定结果

通过优化电泳条件和采用内标分析，改进了测定大豆异黄酮含量的高效毛细管电泳方法（HPCE)，电泳图谱见图7-33。最终电泳条件为：含有5％甲醇的40mmol/L硼砂溶液(pH10.0)为电泳缓冲液，压力进样20s，柱温25℃、分离电压16.5kV，检测波长为254nm，以鹰嘴豆芽素A作为内标物。在此条件下，6种异黄酮组分的峰面积和迁移时间的相对标准偏差（RSD）分别在0.5%-2.4％之间和1.8%-3.8％之间，加样回收率在97.2%-103.3％之间，RSD值均小于4.0%,6种异黄酮组分可在21min内完全分离并具有良好的线性关系。HPCE与HPLC对大豆异黄酮分离均较好，测定结果无明显差异。HPCE是一种检测异黄酮成分较为理想的方法。