参照GB 4789. 38-2012第一法。

(1)检验原理

大肠埃希氏菌（Escherichia coli，也称大肠杆菌）广泛存在于人和温血动物的肠道中，能够在44. 5℃发酵乳糖产酸产气，IMVic（靛基质、甲基红、VP试验、柠檬酸盐）生化试验为++一一或一＋一一的革兰氏阴性杆菌。以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生状况，推断食品中肠道致病菌污染的可能性。

大肠埃希氏菌是广泛存在于人和温血动物的肠道中，既符合大肠菌群的特征，也符合粪大肠菌群的特征，同时叫噪阳性时判为大肠埃希氏菌。因此检验时先测大肠菌群，阳性时检测粪大肠菌群，粪大肠菌群阳性时进行叫噪试验。由于许多产毒菌株生化性状不典型，叫噪阴性，粪大肠菌群阳性时经常需要补做甲基红试验、VP试验和西蒙柠檬酸盐生长试验。三项都符合（分别为＋、一、一）时可判为大肠埃希氏菌。

EMB培养基中，大肠埃希氏菌强烈分解乳糖而产生大量的混合酸，使菌体带H+，故可染上酸性染料伊红，又因伊红与美蓝结合，使菌落呈深紫色金属闪光。而产酸弱的菌株的菌落呈棕色。不发酵乳酸的菌落无色透明。

EMB是一种弱选择性培养基，其他肠杆菌科和一些球菌也可在该培养基上生长（表3-3)。

(2)检验程序

大肠埃希氏菌MPN计数检验程序如图3-9.

(3)操作步骤

样品的稀释同大肠菌群测定。

①初发酵试验：按照GB 4789. 39-2013的方法接种LST肉汤并培养，记录在24~48h内产气的LST肉汤管数。如所有LST肉汤管均未产气，即可报告大肠埃希氏菌类MPN结果；如有产气者，则进行复发酵试验。

②复发酵试验：按照GB 4789. 39-2013的方法做EC肉汤发酵试验。如所有EC肉汤管均未产气，即可报告大肠埃希氏菌类MPN结果；如有产气者，则进行伊红一美蓝（EMB)平板分离培养。轻轻振摇各产气管，用接种环取培养物划线分别接种于EMB平板，(36±1)℃培养18-24h。检验平板上有无具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落。

③营养琼脂斜面或平板培养：从每个平板上挑5个典型菌落，如无典型菌落则挑取可疑菌落。用接种针接触菌落中心部位，移种到营养琼脂斜面或平板上，(36±1)℃培养18-24h。取培养物进行革兰氏染色和生化试验。

④生化试验：靛基质试验、甲基红试验、VP试验、柠檬酸盐利用试验，并按表3-4判断。

a.靛基质试验：将培养物接种蛋白陈水，(36±1)℃培养（(24±2)h后，加Kovacs靛基质试剂0. 2-0. 3mL，上层出现红色为靛基质阳性反应。

b．甲基红（MR）试验：取适量琼脂培养物接种于缓冲葡萄糖蛋白膝水，(36±1)℃培养2-5d。滴加甲基红试剂一滴，立即观察结果。鲜红色为阳性，黄色为阴性。

c. VP试验：取适量琼脂培养物接种于缓冲葡萄糖蛋白陈水，(36±1)℃培养2-4d。加入6%α一蔡酚一乙醇溶液0. 5mL和40%氢氧化钾溶液0. 2mL，充分振摇试管，观察结果。阳性反应立刻或于数分钟内出现红色，如为阴性，应放在（36±1)℃继续培养4h再进行观察。
      d．柠檬酸盐利用试验：取适量琼脂培养物接种于西蒙氏柠檬酸盐培养基，(36±1)℃培养（96±2)h，记录有无细菌生长。

             (4）大肠埃希氏菌MPN计数的报告根据发酵和生化试验结果，只要有1个菌落鉴定为大肠埃希氏菌，其所代表的LST肉汤管即为大肠埃希氏菌阳性。依据LST肉汤阳性管数查MPN表，报告每克（或每毫升）样品中大肠埃希氏杆菌MPN值。