(1）原则

培养基是人工配制的适于微生物生长、繁殖或保存的营养基质。培养基的种类繁多，但一般应具备以下几个条件：含有适宜的碳源、氮源、无机盐类、生长因素等营养成分，含有适量的水分，适宜的酸碱度，具有合适的物理性能（透明度、固化性等）。在配制任何一种培养基时都应掌握以下一般原则。

①营养成分的恰当配比：培养基一般包括碳源、氮源、无机盐和生长素，但比例必须恰当。氨源过多会引起微生物生长过于旺盛而不利于代谢产物的积累，氨源不足则菌体生长过慢。碳源不足容易引起菌体衰老和自溶。一般碳氮比为6:1。但每种微生物的最适配比尚需经实践摸索。微生物所需的磷、硫、镁、钾等常以盐类形式供给。配制培养基时按一定顺序加入营养成分以免产生沉淀而使营养成分损失。一般是先加缓冲化合物，溶解后加入主要元素，再加微量元素，最后加维生素及生长素。

②恰当的培养基浓度：培养基中各种离子浓度会影响营养物质的渗透压和微生物的其他代谢活动。培养基浓度太低，不能满足微生物生长需要，而浓度太高则会使黏度增加、溶解氧降低，亦不利于微生物生长，因此生产上常用恒化连续培养方法，及时补充因微生物生长而耗掉的养分，从而保持恒定生长速率。

③控制适当的pH：每种微生物都有它所能适应的最佳pH，一般来讲霉菌、酵母菌适于微酸性，放线菌、细菌适于中性或微碱性。有些微生物在培养过程中所产生的代谢产物常使培养基的pH升高或降低，因此在配制培养基时也常用缓冲剂（如磷酸氢二钠和磷酸二氢钾等）来稳定其pH。

(2）步骤

配制一般培养基的主要程序可分为：调配、溶化、调整pH.澄清过滤、分装、灭菌、检定等步骤。

①调配：按培养基配方准确称取各成分，用少量水溶解。对于肉膏之类非粉状成分，可盛在烧杯或表面皿中称量，然后加入水。此外，也可放在称量纸上称量后直接放入水中，这时如稍微加热，肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。蛋白胨和酵母膏等呈粉状，容易吸潮，在称取时动作要迅速。此外，维生素、氨基酸、无机盐等微量成分，可预先配成高浓度的贮备液，在配制培养基时再按配方比例加入一定量。

②溶化：将各种成分混匀于水中，最好以流通蒸气溶化0.5 h，如在电炉上溶化应随时搅拌，如有琼脂成分时，应注意防止外溢。溶化完毕，应注意补充失去的水分。制备大量培养基时，除玻璃器皿外，还可用搪瓷桶、铝锅等容器加热溶化，但不可用铜或铁锅，以免金属离子进入培养基中，影响细菌生长。

③调整pH：一般细菌用的培养基pH调整在6.8～7.2之间，但也有需要酸性的培养基。培养基在高压灭菌后pH约降低0.1～0.2，故矫正时应比实际需要的pH高0.1～0.2。但有时也可降低0.4，因所使用的灭菌器不同而稍有不同。调整pH，一般用盐酸和氢氧化钠，因为在相同pH下有机酸比无机酸更易抑制微生物生长，因此除非特殊情况，最好不用乙酸等有机酸来调节pH。

④过滤澄清：培养基配成后，一般都有沉渣或混浊，需过滤，使其清晰透明方可使用。液态培养基常用滤纸过滤，固态培养基如琼脂培养基，于加热后需趁热用绒布或两层纱布中夹脱脂棉过滤。也可采用沉淀澄清法。

⑤分装：根据需要，将培养基分装于不同容量的锥形瓶和试管中，所装的量不宜超过容器的2/3，以免灭菌时外溢。基础培养基一般常分装于锥形瓶或盐水瓶内，所装的量根据使用目的和要求决定，但必须定量分装，以便灭菌后使用。琼脂斜面分装的量为试管容量的1/5，灭菌后须趁热放置成斜面，斜面长度约为试管长度的2/3。半固体培养基分装量约为试管长度的1/3，灭菌后趁热直立，待冷却凝固。高层琼脂分装量约为试管长度的1/3,灭菌后直立凝固待用。琼脂平板是将灭菌后的培养基，冷却至50℃左右，在无菌条件下倾入灭菌平皿内，内径9 cm的平皿倾注培养基约13～15 ml，轻摇平皿底，使培养基平铺于皿底部，凝固后即成。倾注培养基时，切勿将皿盖全部启开，以免空气中尘埃及细菌落入。新制成的平板，表面水分较多，不利于细菌的分离，通常应将平皿倒扣置于37℃培养箱内约30 min，待平板干燥后使用。

⑥灭菌：加热配制培养基后，在2h内进行灭菌处理。不要把未灭菌的培养基冷藏或存放。绝大多数培养基都应在灭菌器内于121℃灭菌，并应达到这一温度后持续15 min。糖类液态培养基或含有其他特殊成分的培养基，高压蒸气灭菌会使其分解，要用滤膜过滤灭菌。或者将不耐热物质用其他方法灭菌（如流通蒸气灭菌）后，再加入已灭菌的培养基中。

⑦检定：每批培养基制成后须经检定后方可使用。每批培养基在使用前，需经无菌检验。可将培养基置37℃温箱内培养24 h后，证明无菌，同时再用己知菌检查在此培养基上生长繁殖情况，符合要求后方可使用，标准菌株的观察指标。对每批培养基，要用试验中作为阳性和阴性对照培养进行检查试验。

⑧保存：配制好的培养基，不宜保存过久，以少量勤配制为宜，可参照所列的存放时间内能用完的量来配制培养基。每批应注明制作日期。已灭菌的培养基可在4～10℃下存放1个月。存放时应避免阳光直射，并且要避免杂菌侵入和液体蒸发。

当发酵试管中的液体培养基存放在冰箱或者适中的低温下时，可能有空气溶解进去，以致在35℃培养时，会在管内形成空气泡。因此，凡在低温条件下贮放过的发酵试管，使用前应先予以培养过夜，弃去有气泡的试管。液态培养基在室温下存放如超过一周，可能有水分蒸发，如果管内液体损失10%，应弃去不用。