转化（transformation）是指细胞发生不可逆转的遗传改变而引起的恒定表型变化的事件。转化细胞系可分为一般转化和恶性转化两种，一般的转化的细胞与原细胞在生物学性状上有所不同，但不具有致瘤性；恶性转化细胞系获得性永生性（immortality）和恶性表型，转化细胞系有三个特征：①有限分裂的细胞变为无限增殖的永久细胞系；②细胞不正常自主性
生长，丧失了细胞的接触抑制等特性；③致瘤性，细胞可以在免疫缺陷小鼠体内呈浸润性生长，形成肿瘤。细胞发生转化及癌变与细胞内基因的变异有直接关系。

细胞体外传代培养过程中，受到培养液酸碱度、小牛血清性质、培养液离子强度、培养温度等多种因素的影响，常可自动发生转化，称细胞的自发转化。自发转化是否是癌变，需要经过实验证实。用化学、物理或生物的因素处理细胞，人为地诱发细胞转化，称为诱发转化。处于S期的细胞最容易受致癌物的影响。从细胞接受刺激到发生恶性转化，一般需要两周到三个月的时间。

体外人工诱发细胞转化

体外细胞转化的过程可以分为诱发、DNA损伤修复和表现等三个阶段。当细胞经受物理因素或化学物质刺激时，细胞DNA受到损伤。例如，紫外线会引起嘧啶核苷酸的交联；甲基硝基亚硝基胍(MNNG）能直接损伤DNA，如作用时间过长或剂量过大会导致细胞死亡。致癌物处理时间一般在6～24小时为宜，受损伤的DNA能借助细胞内的酶系统，进行自我修复，若DNA修复发生错误，并且这种错误被固定下来，形成不可逆的改变时，细胞便发生遗传的改变。从DNA损伤到损伤固定下来大约需要24～48小时。被处理的细胞群不是所有的细胞都受到损害，只是少数细胞的DNA损伤并错误修复，然后进入转化阶段，这些细胞称为癌前细胞（precancerous cell)，分散在正常细胞之中。癌前细胞不断增殖，使细胞损伤得到进一步的发展和表现。当细胞增殖至相互连接成片时，正常细胞接触性抑制，停止细胞分裂。而转化细胞却能继续增殖并堆积，最终形成明显的转化灶。转化细胞体积较大，呈多角形，形似上皮细胞。转化灶经分离培养后能传代形成细胞系，用于细胞生物学和遗传学的研究和检测。体外人工诱发细胞发生转化及恶性转化，对确定环境中的致癌因素和研究细胞的癌变机制有很大的应用价值。

【材料】

1．组织来源金仓鼠乳鼠（用于制备乳鼠肺细胞）。

2．培养基含10％小牛血清的McCoy5A培养液。

3．试剂0.25%胰蛋白酶，0.01% EDTA;Hanks液；甲基硝基亚硝基胍(MNNG）储存液（实验前用McCoy5A培养液配制，浓度为100ul/ml,避光4℃保存，1周内用完）。

4．器材 倒置显微镜、解剖器械、盖玻片、细胞培养瓶、平皿、吸管、离心管、离心机、水浴锅等。

【方法】

1．细胞转化实验的设计与准备

(1)拟转化细胞的选择：拟转化的细胞如果过于稳定，转化效率较低；如果细胞对外界因素过于敏感，细胞容易发生自发转化。所以，拟转化细胞的选择是转化实验的关键所在。用于体外转化实验的细胞主要分为两类：原代培养细胞和传代的正常细胞。被用来研究转化的细胞系有：BALB/313,BHK-21,NIH/313-swiss mouse,Rat-1,PC-12,CHO和V79等。这些细胞都获得了无限增殖的能力，遗传特性已发生变化，但这些细胞仍然保持接触抑制性以及同源动物体内接种没有致瘤性的特点，是转化实验的良好材料。成纤维细胞易于培养、转化，非常适用于检测环境中的可疑致癌物。人成纤维细胞对各种诱变剂耐受性较强，转化率低，但是由于来源方便，适用于研究人的癌变机制。上皮细胞则不容易发生转化。

(2）转化因素的选择：能诱发DNA发生突变的因素都可以促进细胞发生转化。①物理因素：紫外线、X线、放射性核素等；②化学因素：甲基硝基亚硝基胍(MNNG )、甲基甲磺酸等。大多数能诱发动物实验性肿瘤的化学致癌物，一般在细胞培养中不能直接诱发细胞恶性转化，而须经动物的肝微粒体酶系统代谢激活才能发挥作用，这类需要经代谢激活的致癌物称终末致癌物；而MNNG是一种不需代谢激活的直接致癌物；③病毒和外源基因：SV40病毒、EB病毒、癌基因ras, c-myc、端粒酶基因等。根据实验目的不同可选择不同的转化因素。

2．诱导细胞的培养与转化

(1)金仓鼠乳鼠肺细胞培养：出生后2～3日龄的乳鼠6～8只，颈椎脱臼法处死，在无菌条件下解剖，取出肺脏，用Hanks液洗涤3次，置小平皿中用眼科剪剪碎，再用Hanks液洗涤去除红细胞，加入一定量0.25%胰蛋白酶液，置37℃水浴中消化40分钟，再加入冷Hanks液轻轻吹打，使细胞分散，细胞悬液经四层纱布（事先用Hanks液湿润）或200目不锈钢纱网过滤，收集于离心管中，1000r/min离心10分钟，再以含10％小牛血清的McCoy5A培养液定量，制成5x1护/ml细胞悬液接种于细胞培养瓶内，37℃,5% C0₂孵箱中培养7天，待细胞长成单层时，用0.25％胰蛋白酶加等体积的0.01% EDTA液消化细胞，加入培养液，离心，收集细胞，定量后接种到新的培养瓶继续培养。

(2）细胞转化试验：培养的金仓鼠乳鼠肺成纤维细胞加入MNNG，实验包括三个实验组(A,B,C组）和一个对照组（D组），每组至少设三个培养瓶。实验组细胞与不同剂量的MNNG共孵育24小时后，换新鲜的培养液继续培养；对照组细胞不接触MNNG的作用。

A组：MNNG终浓度4ul/ml；

B组：MNNG终浓度2ul/ml ;

C组：MNNG终浓度1ul/ml；

D组：对照。

3．转化细胞的分离与传代

(1)细胞的分离：将培养瓶在倒置显微镜下观察转化细胞，将转化灶用记号笔标记。用消毒的橡皮刮刮除转化灶以外的所有细胞，用PBS清洗3次，去除刮下来的细胞，培养瓶内加入含0.25%胰蛋白酶消化液，37℃消化数分钟。镜下观察细胞变圆时，加入含10％小牛血清的McCoy5A培养液，吹打、分散细胞使成细胞悬液，分瓶培养。

(2）细胞的传代：细胞每隔7天传代一次。传代时应将每组的3瓶细胞消化后混匀，稀释后再接种到培养瓶中，做好标记。每次传代，各组的培养瓶中放置一个小盖玻片，取出后经Giemsa染色留作标本。在传代过程中，要观察培养瓶中细胞的形态和染色的盖玻片标本，若见到细胞有明显的形态学改变，如细胞质和细胞核固缩，细胞从瓶壁上脱落，细胞肿胀，出现空泡、颗粒和破裂等，可能是由于药物毒性反应所致。一般B,C组处理后前几次传代与对照无明显差别，传代至60天左右，细胞将会出现明显的形态变化，正常细胞背景上出现散在的转化灶，B组细胞变化早于C组，肉眼可见转化灶大量细胞堆积形成集落，直径1～2mm。转化灶出现后，由于转化细胞生长迅速，很快就在培养瓶中占优势，最后完全取代未转化细胞。染色的盖玻片上浓染区域在镜下可见转化灶细胞多层生长，排列紊乱、交叉重叠的梭形细胞。

4．转化细胞集落形成试验将转化细胞分别接种于3个平皿，在实验前一天换液。实验当天，见细胞生长情况良好，用胰蛋白酶消化，制备单细胞悬液，计数细胞，稀释至每毫升150～250个细胞，每个平皿接种2m1细胞悬液。置37℃,5% CO₂孵箱培养2～4周。取培养皿，用PBS洗涤，自然晾干，经甲醇固定10分钟，Giemsa染色，显微镜下计数集落，计算集落形成率。

5．裸鼠移植瘤试验将转化细胞接种于裸鼠双侧腋下皮下，各0.2m1[含（2～3)x10⁶细胞]，注射1～2个月后局部有直径1～2mm肿瘤生长，解剖取出肿瘤，做病理切片检查。

【结果】

1．转化细胞的检测

(1)细胞的形态学检查：将培养细胞用倒置显微镜观察。转化细胞呈多边形上皮样细胞，容易与正常成纤维细胞区分，癌细胞失去接触抑制，呈现重叠生长。

(2）染色体分析：可按常规方法制备染色体标本，Gimsa染色，观察50～100个细胞，计数染色体，绘染色体数目分布图；用胰蛋白酶-Gimsa染色法进行G显带。染色体分析可发现恶性转化的细胞出现异倍体，一般为亚二倍体到四倍体之间，还可出现染色体微细结构的改变，如染色体的缺失、染色体重排、易位等；有些转化细胞可有标记染色体。

2．转化细胞体外生长检测

(1)测定生长曲线和倍增时间：培养细胞经历一代，包括潜伏期、对数生长期、平台期三个阶段。一般通过连续计数7天，便可以记录出生长阶段，绘制细胞生长曲线，计算细胞倍增时间，并比较出与正常细胞群生长增殖速度的差别。

(2）转化细胞的克隆效率：克隆效率（cloning efficiency）也可以称为集落形成率。恶性细胞和转化细胞有较高的集落形成率，可以达到10％以上，而正常细胞仅为1%。计算集落形成率是检测群体细胞中增殖细胞的比率，反映细胞系增殖能力、鉴别肿瘤细胞或转化细胞增殖能力的指标。

集落形成率＝平均集落数／每皿接种细胞数X100%

3．微绒毛观察转化细胞可见到较多微绒毛，而正常细胞少见。

4．裸鼠移植瘤实验癌细胞和恶性转化细胞形成移植肿瘤，正常细胞不形成。接种细胞数量不够，恶性转化细胞不形成移植瘤，出现假阴性；若接种细胞过多，正常转化细胞也可能生长肿瘤，出现假阳性。

【注意事项】

1．染色的盖玻片上，正常细胞为单层生长、排列有序，呈成纤维细胞形态；转化细胞浓染区域在镜下可见转化灶细胞多层生长，排列紊乱、交叉重叠的梭形细胞，而两者差别明显。转化灶出现后，由于转化细胞生长迅速，很快就在培养瓶中占优势，最后完全取代未转化细胞。

2．转化细胞的检测内容包括一般的生物学性状，细胞生长速度、细胞形态、细胞周期时间等；细胞遗传学特征，包括染色体组型分析、染色体畸变和标记染色体等；恶性生长测试，包括异体动物接种的致瘤性及浸润性生长实验、软琼脂实验、凝集实验等。在上述的检测中，恶性生长测试最为重要，因为可以断定细胞是否发生了恶性转化，具有成瘤性。

3．染色体分析时，用于显带的标本在制备时宜自然干燥，不要用火焰干燥，可保存1～2周。染色前24～48小时移至45℃温箱中备用。关键是制备好的染色体标本，掌握好胰蛋白酶消化条件。