细胞凋亡（apoptosis）又称程序性细胞死亡（programmed cell death)，是细胞为了维持机体内环境的稳定，由一系列特定基因编码和控制的有序的生理性死亡。细胞坏死（necrosis)是非生理性的死亡。细胞凋亡和坏死是多细胞生物的两种完全不同的死亡形式，在形态、代谢、结局等方面都有本质的区别（表3-3)。有时相对温和的刺激（低剂量的辐射、缺氧、细胞毒药物）可诱导凋亡，而同样的刺激在高剂量则引起死亡。

根据细胞凋亡的上述生物学特征，检测凋亡的方法主要有以下几种：

一、细胞凋亡的形态学检测法

凋亡的细胞有相似的形态学特征，主要表现在：细胞皱缩，细胞器基本保持完整，细胞核固缩，染色质边缘化，细胞膜完整但收缩并内陷，将细胞自行分割为多个具有膜包围的、内含各种细胞成分的凋亡小体（apoptotic body)。凋亡细胞不发生细胞膜、溶酶体等膜的破裂，因此不引起细胞内容物外溢，故不引起炎症反应和周围组织损伤。细胞凋亡是单细胞的丢失，其结局是凋亡小体被机体单核一巨噬细胞等识别、吞噬，迅速被降解。光学显微镜下可以鉴别凋亡，主要通过检测细胞核的变化和观察凋亡小体的形成，但较难，需较丰富的经验。使用透射电镜较为准确，是细胞凋亡形态学检测法的金标准，但较为费时，观察视野小。下面介绍的是用喜树碱诱导凋亡的方法，可以作为检测凋亡细胞的阳性对照。

（一）喜树碱诱导凋亡

【材料】

1．喜树碱储存液I mm溶于二甲基亚砜。

2. Jurkat T细胞系（ATCC TIB-152)。

3．培养基RPMI 1640加10％胎牛血清。

【方法】

1．加喜树碱（终浓度4～6uM）至培养的1×10⁶ Jurkat细胞中。

2．置37℃孵育4～6小时。

【结果】

受试的Jurkat细胞中至少有20％～30％的凋亡细胞。

（二）凋亡细胞的荧光显微镜观察（Hoechst/DAPI染核法）

【材料】

1. PBS配制Hoechst染液活细胞用0.2～5ug/ml，已固定细胞用0.2～2ug/ml。

2. PBS配制DAPI染液300nM。

【方法】

1．制备细胞涂片或组织切片。

2．室温干燥5分钟。

3.4℃下，用0.1% Triton X/PBS通透细胞涂片或组织切片2分钟。

4．用PBS洗3次，每次洗5分钟。

5. Hoechst染液孵育，活细胞染20分钟。已固定细胞染1～15分钟；DAPI染液孵育1～5分钟。

6．用PBS洗3次，每次洗5分钟。

7．抗荧光淬灭剂封片，荧光显微镜下观察。

【结果】

经普通的HE染色或荧光染色等，镜下可以观察到凋亡细胞染色后，出现细胞质浓缩、边缘化、核片段化等典型的凋亡形态。但出现上述明显可见的形态变化时已是凋亡晚期，所以早期凋亡不宜用形态变化来检测。

（三）凋亡细胞的电子显微镜观察

【方法】

1.4℃，于含有2％多聚甲醛,2.5% (v/v）戊二醛,0.1M卡可酸钠（pH 7.4）的溶液中浸泡组织，浸泡约1.5小时。

2.4℃，用0.1 M卡可酸钠（pH 7.4）洗组织2小时，共3次。

3．室温，于1％四氧化锇(0.1M卡可酸钠配制，pH 7.4）中浸泡组织，每次浸泡45分钟，共2次。

4．室温，用0.1 M卡可酸盐缓冲液洗涤，每次10分钟，共2次。

5．脱水。分别用25%,50%,75%,95％乙醇各脱水1次，100％乙醇3次，每次15分钟。环氧丙烷2次，每次10分钟。

6．室温，先将标本浸透于环氧树脂/环氧丙烷（50/50),1小时；再将标本浸透于环氧树脂／环氧丙烷（90/10),90分钟；最后于100％环氧树脂中过夜。

7. 6090，聚合48小时。

8．切片（50～70nm厚），用醋酸双氧铀和枸橼酸铅双染。

9．捞片至碳涂层网格，透射电镜观察。

【结果】

凋亡细胞体积变小，染色质浓缩并凝结成块状，染色质边缘化、核片段化；细胞膜完整。细胞凋亡晚期，细胞核裂解成碎块。产生凋亡小体（图3-1)。