凋亡的细胞在发生凋亡时，内源性核酸内切酶活化和表达，此酶可将DNA在核小体连接部位酶解，使DNA断裂成200bp倍数大小不等的片段，DNA条带呈现梯状（ladder）排列，这一现象可以用琼脂糖凝胶电泳检测。DNA片段化是凋亡晚期现象，凋亡早期不适用此法检测，此方法虽简便，但敏感度较低，需1x10⁶以上凋亡晚期细胞。

（一）琼脂糖凝胶电泳检测梯状DNA条带

【材料】

1．待检细胞（5×10⁶/ml)。

2．试剂 细胞裂解液：50mM Tris-HCI(pH7.5),20mM EDTA,l%(W/V) NP-40。

RNA酶A：终浓度0.5ug/ul。

蛋白酶K：终浓度0.5ug/ul。

100bp DNA分子量标准品。

【方法】

1．将5×10⁵，待检细胞用PBS洗一次，置无菌的1.5m1 Eppendorf管中,4℃,2000r/min离心5分钟，弃上清液。

2．加入50ul细胞裂解液，用移液管混匀。2000r/min离心5分钟，取上清液。再加入50ul细胞裂解液，用移液管混匀。2000r/min离心5分钟，取上清液。

3．加RNA酶A, 56℃孵育120分钟。加蛋白酶K,37℃孵育120分钟。

4．加1/2体积10M醋酸铵，2.5倍的乙醇沉淀DNA。20 OOOr/min离心15分钟，DNA沉淀用TE溶解。

5. DNA样品与溴酚蓝加样液混合后，加样到含0.5 ug/ml溴化乙锭的1.0％琼脂糖凝胶中。同时用100bp DNA分子量作标准品。

6．电泳，凝胶成像系统观察，摄影。

【结果】

凋亡细胞出现梯状DNA条带（图3-2)。

（二）末端脱氧核糖核苷酸转移酶标记法检测细胞凋亡

细胞凋亡产生DNA片段，末端脱氧核糖核苷酸转移酶标记法（terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling assay, TUNEL）利用末端脱氧核苷酸转移酶的作用，对凋亡细胞片段化DNA的3'-OH游离末端进行高效特异性标记FITC-dUTP，然后使用荧光显微镜直接进行观察。对掺入的FIX或dUTP，也可以用过氧化物酶标记的抗体进行检测，与底物显色后使用光学显微镜进行观察。

【材料】

1．通透液含0.1% Triton X-100的0.1%枸橼酸钠溶液。

2．末端脱氧核苷酸转移酶及底物。

3．多聚甲醛(Paraformaldehyde )、蛋白酶K(Proteinase K)。

【方法】

1．标本处理

(1)当使用培养细胞时：收集细胞，PBS进行清洗，载玻片上风干。风干后的细胞使用新配制4% Paraformaldehyde/PBS(pH 7.4）室温固定15～30分钟，PBS清洗20～30分钟。

(2）当使用冻结组织切片时：采取的新鲜组织经快速冷冻后切片，平铺于赖氨酸包被的载玻片上，使用新配制的4% paraformaldehyde/PBS(pH 7.4）室温固定15～30分钟，然后使用PBS清洗20～30分钟。

(3)当使用石蜡包埋组织切片时：将切片进行脱蜡处理，再用Proteinase K (10～20ug/ml)处理15分钟后，用PBS清洗20～30分钟。

2．室温下，使用0.3% H₂O₂甲醇处理细胞15～30分钟，或使用3% H₂O₂水溶液处理石蜡切片5分钟，封闭内源性过氧化物酶，只有在需要辣根过氧化物酶显色时本步骤必须进行。使用荧光观察实验结果时，可以省略本操作。

3. PBS清洗细胞，加通透液含0.1% Triton X-100的0.1%枸橼酸钠溶液100ul，冰上反应2～5分钟，PBS清洗。

4．把预先配制好冰上放置的反应液（含末端脱氧核昔酸转移酶+FITC-dUTP/dUTP）加至载玻片上（为防止反应液干燥，可在反应液上加盖玻片）,37℃，在保湿箱中反应60～90分钟。用PBS清洗。

5．使用流式细胞仪或荧光显微镜观察细胞染色情况。
如使用光学显微镜观察细胞染色情况时，请继续进行以下操作。

6．加Anti-FITC HRP Conjugate/Anti-地高辛dUTP HRP Conjugate，在37℃，反应30分钟（为防止反应液干燥，可在反应液上加盖玻片），用PBS清洗3次，每次5分钟。

7．室温下，使用DAB进行10～15分钟的显色，然后用蒸馏水清洗停止反应。

8．用3％甲基绿（methyl Green)染核，经脱水封片后用光学显微镜观察。

阳性对照：将通透液处理过的标本用重组的DNase (3 U/ml～3000U/ml )作用10分钟，诱导DNA链断裂。

【结果】

凋亡细胞的核在甲基绿的基础上，显棕黄色。

（三）Annexin V/PI检测细胞凋亡

细胞凋亡时，胞膜的磷脂酞丝氨酸外翻，Annexin V是钙离子依赖的磷脂结合蛋白，对磷脂酞丝氨酸有很高的结合力，在细胞膜外可检测到荧光标记的Annexin V。活细胞胞膜完整，碘化丙啶( propidium iodide, PI）不能染核。死细胞和凋亡细胞胞膜不完整，PI可以透过染核。此法敏感，通过流式细胞术可检测出单个凋亡细胞，缺点是无法区分出晚期凋亡细胞和死亡细胞，有些细胞在凋亡早期无胞膜的磷脂酞丝氨酸外翻，也无法用此方法检测。

【材料】

结合缓冲液，FITC Annexin V等来自所购试剂盒，PI：终浓度3um。

【方法】

1．用冷PBS洗细胞2次，调整细胞浓度至1×10⁶/ml，悬浮于lx结合缓冲液。

2．吸取100 ul细胞（1×10⁵）至5m1培养管。

3．加5 u1 of FITC Annexin V和5ul PI。

4．轻微混悬细胞，暗处室温孵育15分钟。

5．每管加400ul 1x结合缓冲液。进行流式细胞分析。

实验应包含以下对照：

1．没有染色的细胞。

2．只染FITC Annexin V的细胞，无PI。

3．只染PI的细胞，无FITC Annexin V。

【结果】

当细胞（Annexin V+/PI-）时，表示早期凋亡；当（Annexin V+/PI+)时，表示晚期凋亡或死亡；当（Annexin V-/PI-）时，代表活细胞（图3-3 )。

（四）检测亚二倍体DNA峰判定凋亡

在进行细胞周期检测时，正常细胞显示二倍体峰（2n)，分裂细胞显示四倍体峰（4n)，凋亡细胞有亚二倍体峰，可以将细胞核用荧光染料染色，用流式细胞仪进行分析。

【材料】

1．缓冲液含1％牛血清清蛋白(BSA) [fraction Ⅳ，无蛋白酶(protease-free);0.01%(w/v)叠氮钠（sodiumazide]的0.1 M PBS缓冲液，4℃保存。

2. RNase A[终浓度40 ug/ml，用含1％牛血清白蛋白（fraction Ⅳ，无蛋白酶；0.01%(w/v)叠氮钠的）0.1M PBS缓冲液配制]，Pl（终浓度50 ug/ml )现用现配。

【方法】

1．将凋亡细胞及作为对照的非凋亡细胞于4℃下，1000r/min离心5分钟。用3ml预冷缓冲液洗一遍，离心弃上清液。

2．加500ul缓冲液轻轻混悬细胞，再加3倍体积冰上预冷的70％乙醇，混悬，4℃放置1小时。

3. 4℃,1000r/min离心5分钟，去上清液。用3 ml预冷缓冲液洗一遍，离心去上清液。

4．用200～500ul含RNase A和PI的缓冲液悬浮细胞，室温避光孵育30分钟。

5．流式细胞仪分析。

【结果】

凋亡细胞有亚二倍体峰（图3-4)。