下蛋母鸡在缺钙情况下，骨内膜中破骨细胞的数量增加，可从其长骨内膜获得破骨细胞进行培养。

【材料】

1．组织来源正 在下蛋周期中的母鸡，用无钙饲料喂养。

2．培养液及试剂 10％胎牛血清的EagleMEM培养液、PBS、含0.1％白蛋白的CMF-PBS等。

3．配制Percoll梯度离心液Percoll是外被聚乙酞胺毗咯烷酮的硅胶颗粒，其基本性质是：密度为（1.103±0.005)g/ml,黏度为（10±5)cP，渗透压＜20mmol/L H20 , pH为8.9±0.3;

（1)配制2种培养液：

A液：普通常规培养基（10% FBS的RPMI 1640培养液）；

B液：20% Percoll的常规培养基。

(2）调整Percoll溶液的密度为1.l0g/ml (用密度计测定），渗透压为290mmo1/L。

(3)按表4-1将二种培养基以不同比例混合，分别配制7个密度梯度Percoll培养基（1.010～1.070g/ml)。

4．器械与仪器无菌手术刀、剪、镊、止血钳，离心机、C0₂孵箱等。

【方法】

1．取材前1周开始用无钙饲料喂养母鸡，使下蛋母鸡处于缺钙情况下。用CO₂吸入法处死母鸡，无菌取鸡大腿长骨，并彻底去除长骨表面附着的肌肉、软组织和软骨。

2．将骨干平放入平皿中，加入在0～4℃预冷的、含有0.1％白蛋白的CMF-PBS缓冲液(pH 7.2）中，以淹没长骨为宜。用手术刀将长骨纵向切开骨干，暴露骨髓,PBS冲洗3次，再用手术刀刮下骨内膜，放入50m1 PBS液中，振荡并制备细胞悬液。

3．用尼龙滤网过滤细胞悬液，以去除碎骨片，用PBS洗涤细胞（1000r/min离心10分钟）后，用5m1 PBS混匀。

4．用带长针头的注射器把不同密度的Percoll培养基分别叠加在50ml离心管中（装有7层Percoll梯度离心液，Percoll密度为1.01,1.02,1.03,1.04,1.05,1.06和1.07g/ml等7个梯度，每梯度5ml)，然后立即用吸管吸取5 ml细胞悬液，小心加在50ml离心管中顶层的分离介质表面。

5．梯度离心与收获细胞以2000r/min离心20分钟，用带长针头的注射器吸取所需密度的第5层（密度1.05g/ml)内的细胞（该部分富含破骨细胞），移入另一离心管中，用PBS洗2次，然后用含10％胎牛血清的EagleMEM培养液稀释，接种浓度约为5000个／cm2，置37℃ ,5% C0₂孵箱中培养。培养24小时，活性破骨细胞已贴壁生长，倒掉培养液，弃去未贴壁细胞，补充培养液继续培养。

6．原代培养的成骨细胞和破骨细胞于6～10天可贴壁铺满瓶底，期间每3天换液1次（图4-1)。贴壁细胞可用胶原酶消化，制备细胞悬液后可进行传代培养，传代细胞可在6天形成单层细胞（图4-2)。

【结果】

从四肢长骨获得的破骨细胞培养物中，常有成纤维细胞、成骨细胞和破骨细胞共同生长。在倒置显微镜下可见破骨细胞数量较少，形态特点是体积大，细胞直径可达20～100um，一个细胞含多个核(2～100个）。用组织化学染色法鉴定破骨细胞时，破骨细胞与抗酒石酸磷酸酶(TRACP）反应呈棕色，与降钙素反应呈蓝紫色，破骨细胞单克隆抗体免疫荧光染色呈阳性。这三项阳性反应是已被公认的鉴定破骨细胞的重要标志。