组织块消化法适用于人脑、肾上腺以及肿瘤组织的毛细血管内皮细胞的分离和培养。与大血管的内皮细胞相比，毛细血管内皮细胞在功能上，特别是对生长因子的反应和对调节黏附分子的表达上有很多不同之处。

【材料】

1．组织来源脑外伤、脑肿瘤或顽固性癫痛手术切除的人脑组织。

2．培养用试剂

（1）清洗液：不含Ca²⁺和Mg²⁺的Hanks或PBS液，添加 200U/ml青霉素、200Ug/ml链霉素和200U/ml庆大霉素。

(2）消化液：0.1% Ⅱ型胶原酶和0.05％胰蛋白酶。

3．培养基配方和制备DMEM或M199，添加15% FBS,4mmol/L谷氨酰胺、3.5g/L葡萄糖、0.1g/L牛胰岛素、0.3g/L肝素、0.15g/L内皮细胞生长附加物、100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素和100U/ml庆大霉素。调整为pH 7.2。

4．实验器材眼科镊和眼科剪、培养皿或培养板、玻璃匀浆器、孔径为78 um和153 um的尼龙网。

【方法】

1．取材将手术中取得的人脑组织浸入预冷的CMF-Hanks液中，用CMF-Hanks液反复冲洗。剥除软脑膜后，将脑组织剪成大小约1 mm3的小块，用CMF-Hanks清洗。

2．消化将剪碎的组织块放入0.05%胰蛋白酶中，37℃水浴条件下，振荡消化10～20分钟。再加入含20% FBS的培养液终止消化。

3．分离细胞用玻璃匀浆器研碎组织块，用孔径为153um的尼龙网过滤组织液。收集滤液，进行500r/min离心10分钟。弃去上清液，用15％右旋糖酐悬浮细胞沉淀，进行1000r/min离心20分钟。吸去上层和中间层，将下层的沉淀用78um尼龙网过滤。收集滤出的毛细血管片段，进行2000r/min离心5分钟。加入0.1% Ⅱ型胶原酶，37℃水浴中振荡消化30分钟，然后进行2000r/min离心5分钟。

4．接种与培养用少量培养液悬浮沉淀的毛细血管片段，静置培养24小时。补充培养液，继续培养5～7天。然后，每隔2～3天换液1次。待细胞生长形成单层时，传代培养。

【结果】

毛细血管片段由数个或数十个细胞组成。培养24小时后大部分毛细血管片段已贴壁，内皮细胞呈小簇状排列。培养5～7天后，细胞生长形成细胞群。2～3周后，细胞生长形成单层。

【注意要点】

1．因毛细血管片段在培养液中容易悬浮，接种时培养液量不宜过多，以免产生浮力而不利于毛细血管段的贴壁生长。

2．在运输脑组织过程中需要使用冰盒，并尽早收集血管内皮细胞。也可将脑组织放入4℃冰箱内暂存，但不宜超过6小时。