血管内皮细胞生长形成单层时，会出现接触抑制现象。因此，应及时进行血管内皮细胞的传代培养。

【材料】

1．培养用试剂

（1）清洗液：HBSS，不含Ca²⁺和Mg²⁺的PBS (CMF-PBS)。

(2）消化液：0.01 % EDTA和0.125％胰蛋白酶混合消化液。

2．培养基配方和制备DMEM，添加10% FBS12mmol/L谷氨酰胺、0.3g/L肝素、3.5g/L葡萄糖、1 mmol/L丙酮酸钠、100U/ml青霉素和100ug/ml链霉素。

3．实验器材涂有明胶的培养皿、吸管和离心管。

【方法】

当内皮细胞生长形成单层时，弃去培养液，用CMF-PBS清洗2次。加入EDTA和胰蛋白酶的混合消化液，室温下消化30秒～2分钟。在相差显微镜下观察到细胞变圆时，吸去消化液。加入培养液，用吸管轻轻吹打，使细胞脱离皿壁。收集细胞悬液，进行1000r/min离心10分钟。吸去上清液，用培养液混悬沉淀细胞，按1:2或1:3的比例传代。培养30分钟后，更换培养液，继续培养。

【结果】

传代培养10分钟后，血管内皮细胞开始贴壁。培养5～7天后，细胞生长形成单层。各种血管内皮细胞都可反复传代培养，最长可达100代以上。

【注意事项】

1．传代培养时，消化液的量应以刚刚覆盖细胞为宜，并注意控制好消化的时间。

2．血管内皮细胞在塑料或玻璃培养底物上汇合后，如培养天数过多，细胞常会剥落；如果长期培养，需要用铺有胶原的底物。

3．原代培养时，消化时间过长，可因消化过度，使内皮细胞底层成纤维细胞混入，导致细胞不纯。

4．培养30分钟后内皮细胞已贴壁时，应及时换培养液，以除去死细胞和非内皮细胞。