淋巴管内皮细胞（lymphatic endothelial cell）是构成淋巴管壁的主要结构，也是淋巴管系统的重要功能细胞。近年发现，淋巴管是肿瘤转移浸润的重要通路，主要是通过引流肿瘤来源的淋巴液和肿瘤细胞形成淋巴管浸润和转移，或者通过给肿瘤提供养料和氧气维持或促进肿瘤细胞的生长。因此，淋巴管内皮细胞的制备和分离培养受到重视。

（一）灌注消化法培养淋巴管内皮细胞

灌注消化法适用于粗大淋巴管内皮细胞的分离与培养。

【材料】

1．组织来源死亡胎儿的胸导管。

2．培养用试剂

（1）清洗液：HBSS，不含Ca²⁺和Mg²⁺。

(2）消化液：250U/ml胶原酶。

3．培养基配方和制备M199或DMEM，添加20% FBS,3.5g/L葡萄糖、2mmol/L谷氨酰胺、2mmol/L HEPES, lmmol/L丙酮酸钠、100U/ml青霉素和100 ug/ml链霉素。调整为pH 7.2。

4．实验器材眼科剪、眼科镊、手术刀、解剖剪、解剖镊和止血钳、涂有1％明胶的培养皿或培养瓶、静脉留置针、注射器和培养皿、培养瓶。

【方法】

1．取材用75％乙醇消毒死亡胎儿胸部，切开胸壁，取胸导管，将其置于预冷的不含Ca²⁺和Mg²⁺的HBSS中。在解剖显微镜下，用眼科剪和眼科镊仔细剥除胸导管外膜的脂肪和纤维组织，然后用HBSS反复冲洗管腔。将血管移入含HBSS的大培养皿中，清洗3次。在淋巴管的远端插入静脉留置针，并结扎固定。用HBSS冲洗管腔后，将游离端结扎。

2．消化通过静脉留置针向管腔内注入胶原酶，至淋巴管充盈为止。在37℃条件下，消化10分钟。

3．分离细胞取出淋巴管，在游离端剪一小口，用离心管收集消化液。然后，用培养液冲洗管腔。将消化液和冲洗液进行1000r/min离心10分钟。

4．接种与培养弃去上清液，用培养液轻轻混悬细胞。将细胞接种于培养皿或培养瓶中，培养24小时，补充培养液，继续培养。每隔2～3天更换培养液1次。换液时，吸去1/2～2/3培养液，再加入新鲜培养液，待细胞生长形成单层时，进行传代培养。

【结果】

原代培养4～6小时后，大部分细胞已贴壁生长。培养24小时后，内皮细胞形成由数个细胞组成的细胞群。淋巴管内皮细胞呈卵石状特征性排列。淋巴管内皮细胞的活性较低，原代培养时细胞生长缓慢。培养2～3周后，细胞生长形成单层。

【注意事项】

1．淋巴管内皮细胞的活性较低，原代培养时细胞生长缓慢。

2．淋巴管的管壁较薄，灌注消化时间不宜过长，以免消化过度，引起成纤维细胞的污染。

（二）植块消化法培养淋巴管内皮细胞

植块消化法适用于较细淋巴管内皮细胞的分离与培养。

【材料】

1．组织来源手术切除的人肠系膜组织。

2．培养用试剂清洗液HBSS，不含Ca²⁺和Mg²⁺。

3．培养基配方和制备M199或DMEM，添加10% FBS, 3.5g/L葡萄糖、2mmo1/L HEPES,2mmol/L谷氨酰胺、1 mmol/L丙酮酸钠、100U/ml青霉素和l00ug/ml链霉素。

4．实验器材眼科剪、眼科镊、手术刀、解剖剪、解剖镊、止血钳和培养皿。

【方法】

1．取材取手术切除的人肠系膜组织，将其置于预冷的无菌不含Ca²⁺和Mg²⁺的HBSS中。在解剖显微镜下，仔细剥除外膜的脂肪和纤维组织。用HBSS清洗3次。用眼科剪纵向剪开管壁，再用HBSS冲洗管腔面。然后，将管壁剪成大小约1 mm³的小块。

2．接种与培养将剪碎的组织块放入培养皿中，使内膜面朝下，放入含5% CO₂ 的培养箱中37℃培养4小时。加入培养液，静置培养3天后更换培养液，以后每隔2～3天换液1次。待细胞生长形成单层时，进行传代培养。

【结果】

培养4～6天后，内皮细胞开始自植块长出，细胞呈短梭形或多角形、扁平的卵圆形、大小均匀。胞核清晰，有核的区域较无核区域突出。培养2～3周后，细胞生长形成单层，并有接触抑制现象。呈典型鹅卵石状或铺路石状镶嵌排列生长。

【注意事项】

加入培养液时操作要轻缓，以避免使植块浮起，而影响淋巴管组织块贴壁与内皮细胞培养。