正常人气管上皮细胞（normal human bronchial epithelial cells, NHBE）在血清存在的培养条件下易于停止细胞分裂，而呈终末分化。LHC无血清培养基是使用最为广泛的支气管上皮细胞培养用品，最适宜NHBE细胞的生长，并可以抑制肺成纤维细胞的生长，而满足培养纯NHBE细胞的需要。因此，一般将呼吸道组织块植入无血清培养液进行分离培养，以保证NHBE细胞的生长和扩增。

【材料】

1．组织来源尸检时取自患恶性肿瘤供体的气管、支气管组织或手术切除的含气管、支气管的正常肺组织。

2.培养用试剂消化液为0.02％胰蛋白酶,0.5mmo1/L EGTA（乙二醇二乙醚二胺四乙酸）和1％聚烯吡酮配制成的胰蛋白酶/EGTA/PVP(聚乙烯吡咯烷酮）液。

3．培养基配方和制备用LHC基础培养液配制的FN/V/BSA混合液：10ug/ml人纤连蛋白、30ug/ml胶原蛋白和10ug/ml BSA结晶。L-15培养液，LHC-9培养液，HB培养液。

4．实验器材眼科剪、眼科镊、手术刀、解剖剪、解剖镊、1Oml和15ml吸管。

【方法】

1．取材

(1)涂布 FN/V/BSA混合液：在60mm培养皿中涂布FN/V/BSA混合液1 ml。将培养皿放入37℃的5% C0₂培养箱，湿润条件下孵育2小时以上，使涂布物固化，但时间不要超过48小时。然后，吸出多余的FN/V/BSA液，加入5m1 LHC基础培养液。

(2)取材：应在死亡后12小时内作尸检，于无菌条件下从恶性肿瘤的供体切除正常肺组织。将肺组织放入用冰预冷的L-15培养液中，送至实验室。然后，从周边肺组织剥离出支气管。培养前用手术刀片在60mm培养皿的底壁边缘刮约lcm2大小的范围。去除该面积上的FN/V/BSA。将支气管浸入L-15培养液中，用HBSS反复冲洗，以除去黏液和血液。用外科剪剪开支气管，再用手术刀切成约20mmx30mm大小的组织片。切组织片时勿锯切。

2．分离细胞将组织片移于60mm培养皿的刮区，上皮面朝上。为免损伤上皮，取组织片时应持支气管外面。弃去培养液，使组织片附着于培养皿的刮区，在室温条件下孵育3～5分钟。

3．接种与培养为了逆转从供体死亡至将肺组织置入用冰预冷的L-巧培养液过程中的上皮缺血损伤，从而改善随后的植块培养，在每个培养皿内加入3 ml的HB培养液，然后将培养皿放入可控气箱内，充入高氧混合气体后，将可控气箱放于摇床平台上。以lOr/min的速度摇晃可控气箱，使培养液间歇地流经上皮表面。37℃条件下孵育1天后换气体和培养液，以后每隔2天换气体和培养液1次，连续孵育6～8天。

在植入组织块之前，用手术刀片在100mm培养皿的底壁上刮出7个区域。用FN/V/BSA混合液涂抹刮过的培养皿，然后按上述方法吸去多余的液体。将缺血逆转的组织片切成大小约7mmx7mm的组织块，再将组织块植于培养皿的刮区中，上皮面朝上。在无培养液和室温的条件下孵育3～5分钟，使组织块贴壁。然后，在每个培养皿内加入10m1 LHC-9培养液，将培养皿放入37℃的含95％空气、5% C0₂的C0₂培养箱，在湿润条件下培养，每3～4天更换新鲜的培养液。培养8～11天后，上皮细胞自植块呈放射状长出。细胞超过0.5cm时，将组织块移入刮过并用FN/V/BSA混合液涂过的培养皿，使上皮细胞长出。为获得大量的NHBE细胞，此步骤可重复7次。得到的NHBE细胞用LHC-9培养液继续培养2～4天，然后用胰蛋白酶/EG-TA/PVP液消化，用于实验或传代。

【结果】

培养3～4天后，气管上皮细胞从植块周边长出。培养1～2周后，细胞长满培养皿底壁。常规传代4次，细胞增殖30倍。

【注意事项】

气管、支气管组织块尽快贴壁是培养成功的关键，初次加入培养液时操作要轻缓，以不使植块浮起为宜。