黏膜上皮细胞的体外培养对环境条件要求较高，操作较复杂。胃黏膜上皮细胞是进行胃病变机制、生理功能、药物治疗等研究的重要工具，已被广泛应用于科学实验。胃黏膜上皮的原代培养细胞与体内细胞的生理状态相似，能反映原始组织的特点，是进行相关研究的理想材料。但胃黏膜上皮细胞对内环境要求较高，分离纯化后不易存活和生长。

（一）胃黏膜上皮细胞培养

正常胃黏膜上皮细胞原代培养中，适于胃黏膜上皮细胞生长的主要条件包括：①应用胶原底物培养；②联合应用透明质酸酶和胶原酶消化法进行细胞消化；③制备含有特定成分的培养基。

【材料】

1．组织来源胃癌或胃溃疡手术切除的正常胃黏膜组织。

2．培养用试剂

(1）清洗液：HBSS，不含Ca²⁺和Mg²⁺的CMF-Hanks或PBS液，添加200U/ml青霉素、200ug/ml链霉素和200U/ml庆大霉素。

(2）消化液：DMEM配制，添加12.5万U/L I型胶原酶或25万U/L I型胶原酶和0.5％透明质酸酶。

3．培养基配方和制备培养液为F12(1:1,V/V）和DMEM的混合培养液，添加5%FBS,5mg/L胰岛素、1％转铁蛋白、2mmo1/L谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100 ug/ml链霉素和100U/ml庆大霉素。调整pH为7.2。

4．实验器材眼科剪、眼科镊、解剖剪和解剖镊、培养皿或培养瓶。

【方法】

1．取材取胃癌或胃溃疡手术切除的正常胃黏膜组织，放入预冷的HBSS中，冲洗3次。在解剖显微镜下，用眼科镊仔细剥除黏膜固有层。将黏膜上皮组织剪成大小约1～2mm³的小块。

2．消化 将剪碎的组织块放入消化液中，在37℃条件下消化1～3小时。然后，加入含血清的培养液，终止消化。

3．分离细胞 将组织液通过200目不锈钢筛网滤过，收集滤液，进行1500r/min离心5分钟。再用HBSS洗涤2次。

4．接种与培养 离心后，弃去上清液，加入培养液，混悬细胞沉淀。将细胞悬液加入培养皿或培养瓶中，培养24小时。弃去培养液，用HBSS洗涤。然后，加入培养液，继续培养。以后每隔2～3天更换液体1次。

【结果】

胃黏膜细胞培养24小时后，细胞贴壁生长，多呈小片状。72小时后，细胞质内出现较多的颗粒。培养后约1周，细胞生长达高峰。胃黏膜上皮细胞呈梭形或多角形，胞质透明。细胞生长可维持2～3周。

【注意事项】

1．胃黏膜上皮细胞不易存活和生长，一般采用原代培养。

2．注意消化酶的选择并注意控制消化时间。

（二）肠黏膜上皮细胞培养

【材料】

1．组织来源死亡胎儿的小肠黏膜。

2．培养用试剂

(1）清洗液：HBSS，不含Ca²⁺和Mg²⁺ 的CMF-Hanks或PBS液，添加200U/ml青霉素、200ug/ml链霉素和200U/ml庆大霉素。

(2）消化液：DMEM，含30万U/L XI型胶原酶和0.1g/L中性蛋白酶混合消化液。

(3）细胞分散液：5% FBS和2％山梨醇，用DMEM配制。

3．培养基配方和制备DMEM含5% FBS,2mg/L胰岛素、2mmol/L谷氨酰胺、20ug/ LEGF,100U/ml青霉素和 100 ug/ml链霉素。

4．实验器材眼科剪、眼科镊、手术刀、解剖剪和解剖镊、培养瓶或培养皿。

【方法】

1．取材取死亡胎儿的小肠黏膜，放入4℃的HBSS中，进行冲洗。眼科剪除去肠系膜，纵行剪开肠壁，用HBSS冲洗3次，洗去黏液。

2．消化将肠壁剪成大小约1 mm³大小的组织块，放入20ml的消化液中，37℃水浴条件下振荡消化30分钟。在消化组织块过程中避免消化液的pH降低是至关重要的，而在消化液中放置的时间影响不大。用吸管反复吹打组织块5分钟，然后进行1000r/min离心5分钟。弃去消化液后，加入HBSS，反复吹打，直至相差显微镜下出现单个的黏膜上皮细胞为止。

3．分离细胞将消化下来的细胞加入分离管中，加入分散液，吹打均匀，静置1分钟。然后，收集含细胞上清液。此步骤重复3～4次。将收集的上清液进行1500r/min离心5分钟。用分散液将细胞沉淀混悬，1500r/min离心5分钟，重复3～4次。

4．接种与培养用培养液混悬细胞沉淀，将细胞悬液加入培养瓶或培养皿中培养。

【结果】

肠黏膜上皮细胞在培养24小时后贴壁生长，以单个细胞分布或呈小簇状。细胞为多角形或梭形。培养2周后，细胞长满培养瓶或培养皿底壁。

【注意事项】

1．为利于细胞的分离，在消化过程中应反复吹打组织块。

2.培养液中血清的浓度不宜过高，以免引起平滑肌细胞和纤维细胞的快速生长，造成污染。