除了口、咽、食管上端和肛门外括约肌是横纹肌外，消化道壁主要由平滑肌组成。消化道平滑肌通过紧密连接，进行同步性运动，完成肌肉的舒缩活动，以推动食物前进，完成对食物的机械性消化，并促进化学性消化和吸收。消化道平滑肌虽然具有肌肉组织的共同特性，如兴奋性、传导性和收缩性，但与骨骼肌、心肌并不完全相同，有其自身的特殊性。平滑肌细胞的培养技术主要应用于血管平滑肌细胞，血管中膜较厚，由大量环形排列的平滑肌纤维组成，细胞易得而且不易污染，目前其培养技术己相当成熟并广泛应用。相比之下，胃肠道平滑肌细胞培养比较困难，主要原因是平滑肌只有2～3层细胞，很薄，难以获得较多的细胞。

（一）肠平滑肌细胞培养

小肠管壁由黏膜，黏膜下层，肌层和浆膜构成。肌层由内环、外纵两层平滑肌组成。以空肠组织为例介绍肠道平滑肌细胞的分离培养。

【材料】

1．组织来源手术患者切除的空肠组织。

2．培养用试剂

（1）Hanks液。

(2)庆大霉素：浓度为100 ug/ml ;两性霉素B：浓度为2ug/ml,

(3) 0.0375％胶原酶。

(4) 0.1％大豆胰蛋白酶抑制剂。

3．培养基配方和制备Dulbecc。基本培养基（DMEM）加入10％胎牛血清、200U/ml青霉素、200 ug/ml链霉素、100ug/ml庆大霉素、2ug/ml两性霉素B,O.0375％胶原酶和0.1%大豆胰蛋白酶抑制剂。

4．实验器材平皿、镊子、剪刀、培养瓶和离心管。

【方法】

1．取材从接受手术的患者取4～5cm的一段空肠组织，获得空肠组织环肌层。沿肠系膜剪开，用冰冷的生理盐水反复冲洗去除肠内容物，至肉眼所见洁净，眼科剪去除肠系膜，眼科镊撕去浆膜层，钝性刮除黏膜及黏膜下层，至所剩组织为透明为止。Hanks液冲洗组织2～3遍，眼科剪将组织剪成2cmx2cm的碎块，用组织切片机将其切成薄组织片，以备消化。

2．消化薄组织片在含有10％胎牛血清、200U/ml青霉素、200 ug/ml链霉素、100ug/ ml庆大霉素、2ug/ml两性霉素B,0.0375％胶原酶和0.1％大豆胰蛋白酶抑制剂的20ml培养液中37℃孵育过夜，观察组织消化情况和消化液颜色变化。

3．分离细胞从环肌层中分离下来的细胞通过500 um的网筛，500r/min离心5分钟。将细胞用DMEM培养液重悬洗涤，500r/min离心5分钟，弃去上清液，加入适量培养液柔和吹打，进行500r/min离心5分钟，弃去上清液，以充分洗去残存的消化液。

4．接种与培养将细胞悬浮在含有10％胎牛血清、200U/ml青霉素，200ug/ml链霉素的培养液中，细胞接种浓度在5x10⁵个／ml，置于95％空气、5% C0₂,37℃和一定湿度的细胞培养箱中培养1.5小时，非平滑肌细胞沉至瓶底贴壁，平滑肌细胞仍悬浮，小心吸出细胞悬液，移入另外的培养瓶中，可得纯度达90％以上的平滑肌细胞，原培养瓶加入培养基继续培养，得到很多杂细胞。取纯化后的细胞悬液，加入锥虫蓝混匀，进行存活率鉴定。36小时后更换培养液，去除未贴壁细胞，每3天换液一次。

【结果】

倒置显微镜下，新分离的细胞为椭圆形或梭形，长度各异，提示处于不同的收缩舒张状态。培养36小时后细胞已贴壁，呈梭形或多边形，细胞核位于中央，为卵圆形，胞质向外伸出长短不一的突起，多数细胞有2～3个突起，细胞较悬浮时折光度降低，立体感强，胞质丰富，无明显颗粒和空泡。3～5天细胞开始增殖，7～10天细胞密集，平行生长，束状排列，密集与稀疏处相互交错呈峰谷样排列走行。

【注意事项】

1．由于小肠的解剖结构复杂，内层黏膜和黏膜下层采用钝性刮除的方法效果好。

2.酶消化法分离平滑肌细胞，酶消化过度容易损伤细胞，影响平滑肌细胞的贴壁，因此消化过程中应针对所分离的细胞源组织的构成，选择适宜的酶，并严格掌握好酶的消化浓度和消化时间。

3．因肌细胞体积较大，将肌组织剪成lmm³的碎块不会大量损伤细胞，而剪碎组织才能使消化液充分接触细胞，达到在有限的时间内尽量消化下来更多细胞的目的，也方便组织转移、吹打。

（二）胃平滑肌细胞培养

胃壁的肌层很发达，由三层平滑肌组成。外层为纵形肌，以大弯和小弯部分较发达；中层为环形肌，在贲门和幽门处变得很厚，形成贲门括约肌和幽门括约肌；内层为斜形肌，由贲门左侧沿胃底向胃体方向进行，以下渐渐分散变薄，以至不见。平滑肌肌肉收缩对胃的蠕动和收缩起着重要作用。

【材料】

1．组织来源接受胃切除术的胃组织。

2．培养用试剂

（I）PBS液。

(2）多黏菌素（50 ug/ml)。

（3）卡那霉素（100 ug/ml)。

(4）谷氨酰胺（100 ug/ml)。

(5)胰蛋白酶(0.5g/L)-EDTA(0.2g/L)混合消化液。

3．培养基配方和制备DMEM中含有20％的胎牛血清、多黏菌素（50 ug/ml)、卡那霉素（100 ug/ml）和谷氨酰胺（100ug/ml)。

4．实验器材手术器材、培养皿和培养瓶。

【方法】

从胃切除术标本的胃壁组织中分离出固有肌层，剪成2cmx3cm的小块，尽量避免包含黏膜、浆膜及任何损伤部位（主要是溃疡）。将组织块进行低温、无菌运输。从手术切除到细胞接种到培养基中的时间不要超过5小时。组织块置于含有培养液的15mm培养皿中。获得的组织样本进一步切成0.2～0.5mm直径的碎块，将其转移到含有20％的胎牛血清培养基的培养瓶中。5% C0₂,37℃进行培养。一旦细胞贴附并开始生长，每4天左右更换培养液。当细胞铺满瓶底，用PBS冲洗细胞，再用胰蛋白酶-EDTA混合消化液消化，进行传代。