在一定条件下，来自多种哺乳动物成体的骨骼肌，可能在体外培养肌原细胞，并可表达一些分化特征。肌原细胞由中胚层细胞分化，可进行有丝分裂。称作卫星细胞的肌原细胞，相互融合在一起，形成多核的肌管细胞(myotubue cell)。随着肌管细胞内肌原纤维的数量增加，肌管细胞成为骨骼肌细胞。成熟的骨骼肌细胞是一种有丝分裂后细胞，不能进行有丝分裂。所以，虽然通过胰蛋白酶消化可进行传代3～4次，但如果发生分化，融合形成肌管，则很难再传代下去。同样，一旦细胞开始融合，细胞增殖也很难评估。

以下所述为肌肉活检组织酶消化法。来自健康人活检的初代培养材料，富含肌原细胞，初代培养在Ham12补加20％胎牛血清培养条件下，很易生长。但原代骨骼肌细胞培养的难点就在于它的纯化，因为成肌细胞和成纤维细胞混杂生长很难区分。在常规培养条件下，这些细胞能够增殖和分化融合形成多核细胞的肌管，证明培养的细胞有成肌性。

【材料】

1．组织来源健康人肌肉活检组织。

2．培养用试剂

（1）培养液Ham F12。

（2）PBS。

(3)链霉蛋白酶（Pronase）液：0.15％链霉蛋白酶和0.03% EDTA，带有20U/ml青霉素和20 ug/ml的链霉素（0.4% Eurobio PES3000)，溶在100ml Ham F12或PBS中。

3．培养基配方和制备Ham F12加20％胎牛血清。

4．实验器材100um过滤网、手术刀、眼科剪、眼科镊、培养皿（切割用）、培养瓶、血细胞计数器和离心管。

【方法】

1．取材用剪刀剪除活检组织的非肌组织，用PBS抗生素缓冲液冲洗3次。按与肌肉纤维平行方向切割成小块，在称量之前用PBS冲洗3次。把组织小块摆放在平皿上，切成lmm³大小的碎块，不要挤压造成伤害，用PBS冲洗3次，弃掉上清。

2．消化在37℃链霉蛋白酶液中消化1小时（1～3mg组织需要15 ml消化液），每3～5分钟摇晃或吸管吹打使细胞分离。用吸管吹打消化物，使更多的细胞分散下来，培养液应变得越来越浑浊。加入含20％胎牛血清的生长培养基终止消化，让组织块慢慢沉到管底。

3．分离细胞集合所得上清液，用100um过滤网滤过入20ml离心管中，进行800r/min离心8～10分钟，吸出上清液弃掉。加10ml生长培养液重悬沉积物，用吸管轻轻吹打，然后用计数器计数细胞。

4．接种与培养用生长培养基稀释悬液，接种入培养瓶中，细胞密度1.5x10⁴个／ml。把培养瓶置入37℃,5% CO₂细胞培养箱中培养。

【结果】

体外培养的骨骼肌细胞，经显微镜鉴定，刚分离出的原代细胞比较小，呈球形，折光性强。12小时后，细胞开始贴壁，72小时后贴壁完全，贴壁后绝大多数逐渐延展成为梭形，少数有突起，为不规则状，首次换液可在培养3天后进行，随着培养时间的延长，细胞增殖、迁移并逐渐规律性地沿一个方向排列（图5-2)。一旦细胞长满整个培养瓶，产生接触抑制，增殖将明显受到抑制，表现为相邻细胞相互融合，形成肌小管，即表现出分化倾向。初始形成的肌小管的多个细胞核沿细胞中心排列，形成中心核链，而合成的少量肌原纤维则位于周边。随着分化的继续，肌原纤维大量生成，逐渐占据细胞中的部位，迫使中心核链的核移向周边，即形成幼稚肌纤维。另外还可以用组织块法培养，约1周可见组织块周围有梭形的细胞爬出，但只是部分组织块周围有细胞。

透射电镜下观察，分裂增殖早期的骨骼肌细胞核含核仁1～3个，细胞质中有不规则分布的束状平行排列的肌丝，部分区域肌丝尚未形成，并有少量幼稚线粒体。早期细胞内有长梭形高电子密度结构，呈散在分布；晚期细胞胞质肌丝更丰实，但无明显肌节形成，可见分化较成熟的线粒体、糖原和游离核糖体聚集于肌束周边，使丰实的肌丝呈束状平行排列。

【注意事项】

1．接种24小时后，轻轻更换培养液，以后每隔3～4天换一次。人肌原细胞约4～6天达增殖高峰，到10～12天细胞融合增加，逐渐出现肌管。但值得注意的是，有的细胞可能分化很早，而其他的却仍在增殖。

2．传代培养代数不要太多，骨骼肌细胞传代能力有限，容易死亡。

3．骨骼肌细胞培养过程中，形态会发生较大变化。

4．肌肉组织要尽可能剔除表面的膜和脂肪组织。

5．为减少成纤维细胞的污染，通过差速贴壁法进行纯化：成纤维细胞贴壁速度快，1小时后就可贴壁，而骨骼肌细胞1小时尚未开始贴壁。

6．用原代培养的骨骼肌细胞可更好的模拟体内状态，尤其是形成成熟的肌管并发生自主节律性的收缩。由于原代的骨骼肌细胞不能无限传代，8代以后细胞就会发生老化。