心肌细胞又称心肌纤维，有横纹，细胞分布广泛，除了心壁上之外，邻心大血管上也有心肌细胞的分布。体外培养的心肌细胞呈短圆柱形，有分支，其细胞核位于细胞中央，一般只有一个，能进行节律性搏动，可见突起，彼此相连成网。一般认为成年的哺乳动物心肌细胞属于终末分化细胞，不能进行有丝分裂。而研究结果表明，心肌细胞确实会在人的一生中缓慢地更新，但是其更新率也在不断地缓慢下降。

【材料】

1．组织来源体外循环开胸手术中切除的患者右心耳组织。

2．培养用试剂

（1）PBS。

(2) 0.2%胰蛋白酶。

(3) 0.1％胶原酶I型。

3．培养基配方和制备Iscove's Modified Dulbecco's Medium含有10％胎牛血清、青霉素（100U/ml）和链霉素（100ug/ml)。

4．实验器材不锈钢网筛、培养皿或培养瓶、手术刀、眼科剪、眼科镊、无菌消毒手术器械和离心管。

【方法】

1．取材切除标本，用PBS洗涤并与结缔组织和血管分离。

2．消化切碎组织块并将其置于含有0.2%胰蛋白酶、0.1％胶原酶I型及0.02%葡萄糖的PBS中，37℃作用15分钟，然后反复吸取混悬液。

3．分离细胞进行1000r/min离心5分钟，弃去上清液。加入培养液5～10m1，并用吸管吹打使细胞分散。再离心（1000r/min, 5分钟）1次，弃去上清液。加入培养液混匀沉淀，制成细胞悬液。

4．接种与培养置细胞悬液于深的玻璃平皿中，在37℃中静止，非心肌细胞能很快附着于培养瓶或培养皿底表面。1～2小时后，非心肌细胞沉淀至瓶底贴壁，而心肌细胞仍在悬浮中。此时小心地吸出细胞悬液，切勿振荡，以免搅动瓶底的非心肌细胞，再分别接种至培养瓶或培养皿中培养。每隔2～3天换液1次。

【结果】

刚接种的心肌细胞尚未贴壁，呈圆形，悬浮于培养液中。培养4小时后，在显微镜下可观察到心肌细胞开始贴壁生长，初为圆形，后为梭形，单个细胞开始搏动，继而细胞逐渐在瓶壁表面铺展，并伸出伪足，形成不规则的星形。随着细胞不断分裂、增殖，逐渐增多，细胞伸出伪足相互接触交织成网，在培养第3～4天可形成细胞单层或细胞簇，呈放射状排列的同心圆状（图5-3)。透射电镜下培养的心肌细胞中游离核糖体、糖原及线粒体较丰富；可见粗面内质网，但滑面内质网稀少，培养数天后可观察到与在位心肌闰盘相似的结构。

【注意事项】

1．差速贴壁法可提高心肌细胞纯度心肌组织经胰蛋白酶溶液消化分散后的细胞悬液中，含有多种细胞成分，但主要是心肌细胞及成纤维细胞，且成纤维细胞的比例比较高。成纤维细胞较心肌细胞更容易贴壁，采用差速贴壁的方法可去除大部分成纤维细胞。

2．尽量减轻分离过程中对细胞的损伤是培养成功的关键。胰蛋白酶可分解组织间质的蛋白成分，但对肌细胞膜蛋白亦起较强的破坏作用，故对其作用时间和浓度的要求较为严格。胶原酶可消化细胞间质的胶原纤维以释放细胞，作用较缓和，对细胞损伤较小。联合使用胶原酶利于离心时细胞沉淀，提高心肌细胞存活率。

3．心肌细胞在略偏酸性环境中（pH 7.0～7.2）更利于生长，培养液储存后pH值逐渐升高，最好现配现用。胎牛血清较新生牛血清含有更多的生长调节因子和营养成分，初次分离的心肌细胞在此环境中生长更好。

4．自发性、节律性搏动是体外培养心肌细胞的重要特征，是反映细胞功能的一项重要观测指标。因此，真实、准确地观测搏动的变化（包括频率、节律、强度及范围等）是十分必要的。