肺泡是肺部的实质组织最末一级分支，外呼吸中气体交换的场所。人肺泡上皮细胞由肺泡I型和II型上皮细胞组成，线性分布于肺内99％以上的表面积。肺泡I型细胞（小肺泡细胞）是一种大而扁平细胞，厚约0.1 um，基底部是基底膜，无增殖能力，其稀薄的细胞质延展占据了其内表面积的95％以上。它含有水通道，是所有哺乳动物细胞中水渗透性最高的细胞。肺泡Ⅱ型上皮细胞（大肺泡细胞）只占据了2%～5％的面积，它能产生、分泌并再利用肺表面活性物质，以降低肺泡表面张力。目前被普遍认为肺泡Ⅱ型上皮细胞通过调节肺Na+传递的活性来维持着肺液体内环境稳定平衡，而肺泡I型细胞是无活性的细胞，仅提供屏障功能而无活化功能。肺泡上皮细胞对维持肺泡的结构和功能以及在肺损伤后表面活,性物质的分泌、肺水转运过程中均具有重要意义。但由于该细胞具有特殊的生物学特性，尚未形成细胞株供研究用，且其分离、纯化、鉴定及原代培养的操作较为烦琐，细胞形态功能易发生变化，给研究工作带来不便。

【材料】

1.组织来源胸外科接受肺切除的肺癌患者，选取距肿瘤部位较远的肺组织。

2．培养用试剂

(1)蛋白酶Ⅱ：终浓度为2.0U/ml。

(2）胶原酶／蛋白酶：终浓度为lmg/ml。

(3）DNase I：终浓度为0.1 mg/ml。

(4）红细胞裂解液。

(5）丝裂霉素C。

3．培养基配方和制备DMEM含10％胎牛血清、1%氨基酸溶液、100U/ml青霉素、l00 ug/ml链霉素和2.5 ug/ml两性霉素B。

4．饲养层细胞准备小鼠胚胎成纤维细胞来源于妊娠13或14天的孕鼠C57BL/6。制备铺有小鼠胚胎成纤维细胞（饲养细胞）的培养皿或培养瓶，用丝裂霉素C进行有丝分裂的灭活，备用。

5．实验器材不锈钢网筛(100um,40um)、培养皿或培养瓶、手术刀、解剖剪、解剖镊、眼科剪、眼科镊、无菌消毒手术器械和离心管。

【方法】

1．取材距离胸膜3cm取肺组织。胸膜被彻底剥离后，肺组织被切成lcmxlcmxlcm小块，用不含血清的培养液洗净组织小块。

2．消化样品在蛋白酶II的作用下膨胀，放入含蛋白酶、胶原酶／蛋白酶和DNA酶I的锥形管中，并在37℃振荡孵育90～120分钟。

3．分离细胞酶消化后的样本用剪刀剪碎，并用100 um网筛过滤。细胞经红细胞裂解液处理后，通过40um的网筛过滤，用DMEM重悬。

4．接种与培养将细胞按（1～5)x10⁴/cm²的浓度接种到铺有有丝分裂灭活的小鼠胚胎成纤维细胞（饲养细胞）的培养皿或培养瓶中，置37℃,5% C0₂细胞培养箱中培养。在细胞培养的第一周加两性霉素B (2.5 ug/ml )。

【结果】

纺锤状细胞开始培养后6～10天产生集落。集落形成细胞不断增殖，在4周左右汇合。纺锤状细胞可以传代并均匀扩增。后续的培养不再需要饲养细胞。培养七代左右之后，细胞形态变宽且扁平，这表明细胞老化开始出现。

电镜下可见细胞形状较规则，细胞表面有很多长短不一、粗细不等的微绒毛，胞核明显，胞质内含有大小不一同心圆或平行排列的板层小体，少数细胞可以见到板层小体被分泌到细胞外。

【注意事项】

1．细胞在原代培养第24～72小时内处于最佳生长状态，此时适合用于体外实验研究。

2.胰蛋白酶消化时间不宜过长。

3．每天观察细胞形态，掌握好细胞是否健康的标准：健康细胞的形态饱满，折光性好，生长致密时即可传代。