检查受微生物感染的机体有无特异性抗体，称为血清学诊断。利用抗原与抗体能发生特异性结合的特点，用已知的病毒抗原检测患者血清中相应抗体，是病毒血清学诊断的基本原理。对病毒性感染的血清学诊断最常用的方法是中和试验、补体结合试验、血凝抑制试验等，其中中和试验最为常用。用动物、鸡胚和细胞培养均可进行。中和试验多采用细胞培养方法进行测定，其原理是将系列稀释的血清与病毒液混合后，再分别感染细胞，测定病毒的感染性，观察血清对细胞的保护作用。如果细胞不出现病变，则证明血清中有病毒特异抗体存在。效价高低是以能保护半数细胞不产生CPE的血清最高稀释倍数来表示。用此试验可检测患者血清中抗体的消长情况，常用于病毒感染的流行病学调查；也可用来鉴定未知病毒或研究病毒的抗原结构。下面以单纯疱疹病毒（herpes simplex virus, HSV）为例，介绍细胞培养法中和试验来测定抗中和抗体，包括蚀斑减少法和细胞病变法。

一、蚀斑减少法测定中和抗体

【材料】

1．待测血清无菌采集受检者末梢血5m1置离心管中，凝固后2000r/min离心5分钟，吸血清，经56℃灭活30分钟后冰箱冻存。

2. HSV-1型病毒（预测定PFU)。

3. Vero单层细胞培养皿（60mm）或培养瓶14支。

4. PBS、培养基A液、B液和C液等，配制方法同空斑定量法。

5．无菌试管、各种吸管（2ml,lml,5ml)、无菌注射器及离心管（10ml)。

【方法】

1．待测血清稀释取7支小试管，按表8-5倍比稀释血清。

2．病毒稀释将HSV-1型病毒稀释，使其浓度为1000PFU/ml,

3．取各稀释度血清0.5 ml加入试管中，各管中分别再加入0.5 ml病毒液（1000PFU/ml)，混匀后37℃作用1小时。

4．取各管血清与病毒混合物0.2m1，分别加入单层培养Vero细胞培养皿（瓶）中，每稀释度接种2支平皿（瓶），加预温A,B混合培养液4m1，凝固后反转培养3～4天后，再加C液(1％中性红琼脂培养基）2m1，凝固后培养数小时或过夜，测定各平皿（瓶）的空斑数。

【结果判定】

活细胞被中性红染成红色，病毒感染灶形成无色空斑清晰可见。以病毒对照（即PBS代替血清）的2个平皿的平均空斑数为准，将不同浓度血清各管中和病毒后形成的空斑数与病毒对照空斑数相比较，以出现空斑数为病毒对照半数的血清最高稀释倍数定为中和抗体的效价。

【注意事项】

1．将各管稀释血清与病毒液作用时先要充分混匀，便于准确计算形成的空斑数。

2.覆盖琼脂培养基要维持在42℃左右，不能过凉和过热，过凉琼脂易凝，过热易使病毒失活。

二、细胞病变法检测中和抗体

【材料】

1．已呈单层的Vero细胞培养瓶12支（或12孔培养板培养的Vero细胞）。

2．含2% FCS的MEM（或RPMI 1640）维持液。

3．已知HSV-1病毒液，浓度为100TCID50/0.1 ml。

4．待测血清，经56℃30分钟灭活。

5. PBS缓冲液。

6．试管、吸管（2ml,lml,5ml）等。

【方法】

1．倍比系列稀释待测血清取7支小试管，用PBS按1:5,1:10,1:20 ...1:160倍比稀释，稀释方法同空斑减少法。

2．分别取各稀释度血清0.5 ml于小试管中，每管加等量病毒（100TCID50/0.1 ml)混匀，置37℃作用1小时。

3．取各管血清、病毒混合物分别接种细胞培养瓶（孔）中，每瓶（孔）0.2m1，补加维持液至1 ml，同时设病毒对照、细胞对照、血清对照。置37℃,5% CO₂孵箱培养3～5天。

【结果】

倒置显微镜下，逐日观察细胞病变（CPE）并计算中和效价。细胞对照、血清对照不出现病变，病毒对照出现3⁺～4⁺时判定结果。如病毒与血清混合液接种瓶不出现细胞病变(CPE)，则表示该血清具有中和病毒能力，以细胞完全不出现CPE的最高血清稀释倍数作为中和效价。

【注意事项】

1．进行中和试验时所使用病毒要预先测定毒力，病毒TCID₅₀（或PFU）和血清稀释倍数要准确。

2．进行临床血清学诊断时，要采集待测者初期和恢复期双份血清，而且双份血清应同时测定效价，恢复期比初期血清效价≥4倍时，方有诊断意义。