抗病毒药效测定实验分为体内试验和体外试验。体外试验是采用细胞培养法来观察药物的抗病毒作用。在实验中要根据药物的特性来选择病毒；根据病毒对细胞易感性选择所用细胞；观察药效指标常采用病毒致细胞病变效应（CPE）情况来判定药物的抗病毒效果（病毒必须在感染细胞上出现CPE)。下面以抗呼吸道病毒药物为例，采用微量细胞培养法介绍药物体外抑病毒试验方法。

一、药物对细胞毒性的测定

【材料】

1．待检药物过滤除菌。

2．对照药物确为有效的有批准文号同类、同剂型药物做阳性对照药物。

3．细胞Hep-2细胞。

4．病毒腺病毒一型（或呼吸道合胞病毒）。

5．细胞培养液含10% FCS的RPMI 1640（或10% FCS的MEM)；维持液为2% FCS的RPMI 1640（或2% FCS的MEM)。

【方法】

采用微量培养法。目的是选出药物对细胞无毒稀释度，即无毒限量的选择。

1．预先将Hep-2细胞用10% FCS的RPMI 1640培养于96孔微量培养板内，置37℃,5% C0₂孵箱内培养18～24小时，待细胞长成单层后，弃去孔内培养液。

2．待检药物稀释：分别于10支小试管内将待检药物及对照药物用细胞培养液递倍稀释（原液、1：2,1：4,1：8,1：16,1：32,1：64,1：128,1：256,1：512)。

3．分别取0.1ml不同倍数稀释的待检药物及对照药物滴加于细胞培养孔中，每个浓度平行4孔，同时设细胞对照孔（不加药，仅加培养液）。再对每孔补加0.1 ml细胞培养液。置37℃,5% CO₂孵箱内培养。

【结果】

显微镜下逐日观察并记录细胞病变结果，直至药物对细胞的毒性不再继续进展时判定结果，以不出现细胞病变的药物最小稀释倍数为无毒浓度，分别算出待检药及对照药的无毒剂量（no-toxic dose, TD₀ )，并计算最大的无毒剂量及半数有毒剂量（50% toxic dose,TD₅₀）。

二、病毒毒力测定（微量培养法）

【材料】

1．待检药物过滤除菌。

2．对照药物确为有效的有批准文号同类、同剂型药物做阳性对照药物。

3．细胞Hep-2细胞。

4．病毒腺病毒-3型（或呼吸道合胞病毒）。

5．细胞培养液含10% FCS的RPMI 1640（或10% FCS的MEM)；维持液为2% FCS的RPMI 1640（或2% FCS的MEM)。

【方法】

1．将使用的病毒液（如腺病毒-3型）用维持液（或PBS) 10倍连续稀释（10^-1,10^-2,10^-3，... 10^-7）。

2．将预先于96孔板培养生长成单层的Hep-2细胞各孔中培养液吸掉，每孔加入不同浓度病毒液0.1 ml, 37℃吸附1小时后，各孔再补加0.l ml维持液，每浓度3孔，同时设正常细胞对照孔。逐日观察细胞病变。

【结果】

计算病毒50％细胞感染量（TCID₅₀)，以病毒能引起50％细胞病变（CPE）的稀释倍数作为病毒TCID₅₀。

三、抗病毒药效试验（微量细胞培养法）

【材料】

1．待检药物同前，过滤除菌。

2．对照药物同前，确为有效的有批准文号同类、同剂型药物做阳性对照药物。

3．细胞Hep-2细胞。

4．病毒腺病毒-3型（或呼吸道合胞病毒）。

5．细胞培养液含10% FCS的RPMI 1640（或10% FCS的MEM)；维持液为含2% FCS的RPMI 1640（或2% FCS的MEM)。

【方法】

1．预先用96孔培养板将Hep-2细胞培养成单层细胞。

2，弃去培养孔中的培养液，向每孔加入10～100TCID50/0.1ml（或20～40PFU/0.1 ml）腺病毒，吸附1小时，倾去病毒液（也可不弃）。

3．将待检药物与对照药物分别选用最大无毒剂量（TD₀）药液，用维持液分别递倍稀释两种药物的7个浓度（原液、1:2,1:4,1:8,1:16,1:32,1:64)。取每个浓度药液0.1ml分别加入已感染病毒的细胞孔内，每浓度3孔。各孔补加0.1 ml维持液。同时设细胞对照（仅加维持液）、药物对照（不加病毒）病毒对照（不加药液）。置37℃,5% CO₂孵箱内培养。

【结果】

逐日显微镜下观察细胞病变（CPE)。当病毒对照出现4+细胞病变时，判定不出现细胞病变的药物最高稀释倍数。计算出抑制指数（药物抑制病毒的最高稀释倍数除以药物无毒浓度）。

【注意事项】

1．药物对病毒抑制作用，可采用不同时间：①药物先作用细胞后，再感染病毒；②药物与病毒先混合作用1小时后感染细胞；③将两者等量混合后同时加入细胞内；④对细胞先感染病毒1～2小时后再加药物。

2．药物毒性测定指标，根据药物和病毒特点选用：①细胞病变观察；②活性染色如锥虫蓝染色拒染法计数活性细胞；中性红和MTT染色后测OD值；③3H核素掺入，计算最大的无毒剂量TD₀及半数有毒剂量TD₅₀。

3．根据病毒特点可选用病毒毒力指标：①观察细胞病变（CPE）测定TCID₅₀;②细胞活性染色，如中性红染色（活细胞红色）；MTT染色（活细胞青紫色）；③病毒空斑（PFU/ml)测定；④病毒抗原测定，可用ELISA, EIA, RIA法；⑤病毒核酸测定，可用核酸杂交、定量PCR法。

4．如果待测药物是中药煎剂，必须进行无菌滤过，使药液无沉渣，以免影响结果观察。