病毒在细胞内增殖有复制过程，即复制周期，其结果造成细胞损伤，在体外能观察到细胞所发生的各种病理变化，目前尚可通过研究病毒与细胞受体相互作用，测定生物合成产物，检测细胞凋亡和膜抗原变化及基因整合情况等，从分子水平上来研究病毒的致病机制。

一、概述

病毒对人及动物的致病机制可以从细胞水平及机体水平两方面研究。动物实验可应用于病毒在机体水平的致病研究；细胞培养技术可应用于病毒对细胞的致病机制研究。这是因为病毒具有严格的细胞内寄生性，其致病基础是病毒在宿主细胞内增殖，可导致细胞损伤或变化。例如有些病毒在细胞中增殖时，能在显微镜下观察到细胞溶解等明显CPE现象，致使被感染细胞死亡，无包膜病毒便是如此，其致病机制主要是通过直接杀伤效应来实现的。如果病毒感染细胞在显微镜下观察到细胞融合，出现多核巨细胞等，说明这些病毒不是通过杀细胞效应，而是通过引起细胞膜变化等，导致感染细胞与邻近细胞的融合，有包膜病毒是借此方式在细胞间进行扩散的。当病毒引起的损伤扩延到多数细胞时，便可形成组织器官的损伤或功能障碍。因此细胞培养法是研究病毒在细胞水平上致病机制的良好手段。

（一）细胞病毒受体

病毒对人体组织有选择性，也就是病毒仅对敏感细胞有亲嗜性，如果组织细胞表面有某种病毒的受体，则病毒表现出对该组织的亲嗜性，该组织则成为病毒感染的靶器官。病毒在细胞内增殖，首先要进到细胞内，在细胞内复制大量子代病毒，再释放到细胞外。此过程一般需要吸附、穿入、脱壳、生物合成、装配与释放等五个阶段，又称复制周期。经过病毒复制，宿主细胞发生变化。吸附过程实质是病毒与宿主细胞表面受体的结合阶段，是构成感染的第一步。因此研究病毒对细胞的致病机制，首先应研究清楚病毒受体、病毒与受体结合的机制等。通过细胞培养观察病毒对细胞的致病变作用是研究病毒的致病机制最常用的方法。也可通过电镜观察病毒在细胞内增殖的动态变化。

病毒受体可从以下几方面进行研究：

1．确定某种病毒对细胞的亲嗜性。

2．确定敏感细胞表面对该种病毒的特异性受体。

3．病毒与相应受体结合的生化基础与动力学改变，包括结合方式及结合后细胞发生的生理功能变化。

4．病毒受体的纯化。

5．病毒受体基因构建及表达等。

（二）病毒受体研究方法

利用经典研究受体的方法及现代分子生物学技术对上述病毒受体的研究方向完全可以实现。归纳起来，目前应用于病毒受体研究的主要技术方法如下。

1．利用杂交瘤技术制备细胞表面受体的单克隆抗体，用单克隆抗体封闭或阻断病毒与细胞受体的结合来研究两者结合的特异性。

2．利用合成特异性多肽与细胞表面受体进行竞争性结合，研究病毒受体的结构及作用部位。

3．利用人工合成多肽、序列删除、氨基酸置换等方式模拟病毒配体与细胞病毒受体、辅助受体及其他分子的作用机制。

4．利用酶的作用去除细胞表面的受体，观察对病毒吸附细胞、穿入细胞的影响。

5．分离和纯化病毒受体。

6．利用病毒受体蛋白免疫血清的细胞保护性实验，研究病毒受体抗血清对病毒受体的阻断作用。

7．利用基因克隆技术克隆病毒受体的基因，再利用转基因技术使受体缺陷性细胞（非容许性细胞）获得特异性受体，并通过观察病毒感染细胞的结果验证受体的存在。

8．利用X射线衍射技术直接获得病毒与受体结合的过程。

二、受体蛋白免疫血清的细胞保护性实验

【材料】

1.病毒轮状病毒，浓度为100TCID₅₀/ml。

2．细胞24孔培养板MA104细胞单层细胞培养。

3．细胞培养液RPMI 1640培养液、FCS等。

4. TBS缓冲液10mmol/L Tris-HC1,0.9% NaCl,pH 8.2,NP-40(NouidetP40，乙基苯基聚乙二醇）。

5. Hanks液。

【方法】

1．可溶性轮状病毒受体制备大量培养的MA104细胞，用TBS洗2次，按10，个／ml细胞浓度溶于含1% NP-40的TBS缓冲液中，置4℃ 1小时并每15分钟摇动1次，4℃ 1500r/min离心5分钟，吸上清液，于-70℃速冻，即为MA104细胞可溶性受体。再经饱和硫酸钱沉淀及免疫亲和层析法纯化，即为纯化病毒受体蛋白。

2．受体蛋白免疫血清制备取BALB/C小鼠多只，皮下多位点注射纯化MA104细胞受体蛋白，每位点4 ug。于第2,3,5,6周每只鼠经尾静脉加强注射受体蛋白4 ug，第7周眼内毗静脉取血分离血清，即为受体免疫血清。

3．细胞保护性试验将MA104细胞培养于24孔板，待细胞成层后，用Hanks液将细胞洗2次，加入用RPMI 1640液3倍稀释的受体免疫鼠血清，每孔0.1ml，共4孔，同时设3种对照，即正常细胞、正常鼠血清及病毒对照，每种对照4孔。于37℃作用1小时后，各孔均用Hanks液洗3次，并加入胰蛋白酶预处理的轮状病毒，每孔0.1ml，于37℃作用1小时后，加维持液至lml,37℃,5% CO₂孵箱培养24～48小时，逐日观察CPE。

【结果】

显微镜下观察并分析接种病毒24～48小时MA104细胞CPE情况。如果正常鼠血清对照孔CPE为3⁺～4⁺;免疫血清实验组CPE为-或±；单纯病毒对照孔的病变为3⁺～4⁺时，即说明受体免疫血清起到保护作用，可以阻断病毒与细胞受体的结合，而使病毒不感染宿主细胞，即不出现CPE。