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人类病毒中有许多病毒,如HSV,CMV,EBV,HPV和腺病毒的某些型别,能转化体外培养细胞,这些具细胞转化能力的病毒和病毒的致瘤潜能有密切联系,因部分转化细胞在动物实验中可以变成肿瘤细胞。病毒转化细胞多具有旺盛的生长力,易于连续传代,细胞表面可出现新抗原,而且多数细胞染色体中整合有病毒DNA。这些细胞生物学行为的改变,称为细胞转化(cell transformation)。能使细胞发生永生化、转化及癌变作用的病毒亦称之为肿瘤相关病毒。利用细胞培养技术可以探讨肿瘤相关病毒对细胞转化以至于致癌的机制。其原理是将肿瘤相关病毒感染培养细胞,通过各种显微镜检查及相关试验来观察细胞的形态学变化、增殖能力等生物学性状的变化,以及癌基因、抑癌基因和致突变性等分子生物学鉴定。
EB病毒(Epstein-Barr virus, EBV)具有在体外可使人B淋巴细胞发生感染,并能诱导淋巴细胞发生转化的特性,转化的细胞可以无限地生长下去,形成永生性细胞系。因此常用EB病毒转化人B淋巴细胞试验来研究EB病毒致病机制。
EB病毒转化人B淋巴细胞试验
【材料】
1.外周血单个核细胞可来自健康人或患者外周血。
2.病毒EB病毒的B95-8细胞培养液经0.45 mm滤膜过滤后,-70℃冻存。
3.淋巴细胞分离液。
4.培养液 20%胎牛血清RMPI 1640培养液。
5.磷酸盐缓冲液(PBS, pH 7.4)。
【方法】
1.外周血单个核细胞的分离收集患者新鲜抗凝血5~8 ml,加入等体积的PBS稀释。然后,将稀释血液缓缓加入到淋巴细胞分离液面上(稀释血液与分离液之比为2 : 1) , 2000r/min,离心15分钟。吸取单个核细胞(PBMC)层,加入无胎牛血清的RMPI 1640培养液5ml,离心洗涤细胞,反复3次。用20%胎牛血清RMPI 1640培养液将细胞配制成浓度约为106/ml细胞悬液。
2. EB病毒的转化取单个核细胞悬液1~2m1和EB病毒液0.2~0.5ml (105 TCID50/ml),在37℃水浴摇床孵育2小时之后,将混合液以0.2m1/孔滴入%培养孔板中,37℃,5% CO2的孵箱中培养。每周半量换液1次,连续传代培养,可获得永生化B细胞无限细胞系。
3.克隆细胞株建立用单细胞克隆法对永生细胞系进行细胞克隆培养。将获得的永生化B细胞无限细胞系再经有限稀释后,接种于96孔塑料培养板,使每孔接种的细胞大约为1~2个,即可获得EB病毒转化的永生化PBMC传代细胞株的克隆细胞。
【结果】
培养后培养液有变酸的现象。低倍显微镜可见到细胞呈现有淋巴母细胞样的细胞团状或簇状增殖生长。
用EBV抗体对转化的淋巴母细胞或培养上清液,做ELISA试验检测EBV抗原,可进一步证实EB病毒感染细胞成功。
另外,还可以做病毒的实验性再感染来滴定病毒效价。
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