实体瘤细胞种类多，因其组织来源不同而具有不同的组织特征及标记物，因此分化诱导的判定标准各不相同，例如神经母细胞瘤经神经生长因子（nerve growth factor, NGF）诱导分化后会出现神经元样分化（图9-2)，实体瘤分化诱导的实验方法也差异明显，现以肝癌Be17402细胞分化诱导实验简要介绍。

甲胎蛋白（AFP）在肝癌中分泌量很高，而在正常成人肝中则无分泌，因此AFP是诊断肝癌的标志蛋白。γ-GT同功酶在成年鼠肝中活性极低，而在诱癌过程中活性逐渐上升，故γ-GT也是一个公认的肝癌标志。另一方面，白蛋白及TAT在肝细胞中的情况恰恰相反。白蛋白是成熟肝细胞分泌的蛋白，是肝细胞成熟分化的标志。TAT( tumor associated trypsin）在正常肝细胞中活性较高，而在肝脏癌变时活性下降，因此它是肝细胞分化的标志之一。肝癌Be17402细胞己被证明具有高的AFP分泌及，γ-GT活性，而白蛋白及TAT极低。因此，利用此细胞株，在体外测定这些蛋白的含量及活性，就可判断肝癌细胞的分化程度。

（1) γ-GT及TAT活性测定

【材料】

1)试剂Tris,γ-谷氨酰胺-α-萘胺，硼酸，氨基苯磺酸，亚硝酸钠，L-氨酰 α-萘胺，L-酪氨酸，磷酸吡哆醛，EDTA,DTT,α-酮戊二酸，KOH,磷酸氢二钠，磷酸二氢钾，α-萘胺，对羚基苯甲醛。

2）仪器：细胞刮，细胞超声破碎仪，恒温水浴，紫外可见分光光度仪。

【方法】

1)将生长良好的细胞制成1x10⁵/ml细胞悬液，接种于20ml培养瓶中，每组平行用3瓶，置37℃ ,5% CO₂培养箱中预培养24小时。

2）加入不同浓度药物、对照组加入相应溶剂，继续在培养箱中培养4～8小时。

3)弃培养基，细胞用PBS洗2次、迅速用细胞刮刮下，4℃,1000r/min离心10分钟，弃上清液，将细胞沉淀悬在0.05mol/LTris缓冲液中，在冰浴下破碎细胞，制成细胞匀浆，4℃,20 000r/min高速离心5分钟，取上清液测γ-GT及TAT活性。

4)γ-GT活力测定：①反应所需溶液：基质缓冲液： 10umol/L γ-谷氨酞胺-α-l萘胺硼酸缓冲液，pH 9.0 ;重氮试剂：0.2%氨基苯磺酸，0.1％亚硝酸钠24：1，临用前混合；②测定方法：取制好的细胞上清液50ul,5m1重氮试剂，0.25 ml基质缓冲液，室温放置10分钟，以对照管调零，在520nm处测光密度值。

5) TAT含量测定：反应所需溶液0.125mol/L磷酸缓冲液，pH 7.6;0.7mmol/L L-酪氨酸，溶于0.125 mol/L磷酸缓冲液中，pH 7.6;4.05mmol/L磷酸吡哆醛;100mmol/L EDTA;100mmol/L DTT;3.24mmol/L。α-酮戊二酸，继续保温10分钟，加入10mol/L KOH 0.2ml，剧烈振荡终止反应。37℃继续保温30分钟，对照管中加入氢氧化钾终止反应后加入细胞匀浆，以对照管调零，在331 nm波长处测吸收光度。

6）制备α-萘胺标准曲线及对羟基苯甲醛标准曲线。

7）蛋白含量测定-考马斯亮蓝法：以牛血清清蛋白为标准曲线，用考马斯亮蓝染色，在紫外可见分光光度计595 nm处测定光密度值做标准曲线，根据标准曲线，求出被测液的蛋白含量。

【结果分析】

1) γ-GT活力：根据α-胺标准曲线算出α-l萘胺释放量，并换算为每小时每毫克蛋白释放a-萘胺的nmol数。

2) TAT活力：从对羟基苯甲醛的吸光度标准曲线上求出对羟基苯甲醛的量，从而得出酶反应产物对羟基苯酮酸的量，每毫克蛋白每分钟形成的对经基苯酮酸的u mol数即为TAT的比活性。

(2）甲胎蛋白（AFP）和白蛋白（ALB）分泌量测定。

【材料】

1)试剂盒：125I标记的甲胎蛋白放射免疫测定试剂盒，125I标记的白蛋白放射免疫测定试剂盒；

2）仪器：冷冻干燥仪，γ-计数仪。

【方法】

1)取对数生长期肝癌细胞，计数并制成1x10⁵/ml细胞悬液，接种于大号培养瓶中，24小时后按试剂盒操作要求加药，培养4～6天后每组收集80ml细胞上清液，冷冻干燥，备用。

2）细胞用0.1% Trypsin消化后按锥虫蓝排斥法计数活细胞数。

3）冷冻干燥样品溶于1.2ml PBS，分别用125I标记的白蛋白放射免疫测定试剂盒，和125I标记的白蛋白放射免疫测定试剂盒，通过γ-计数仪测定。

【结果分析】

AFP,ALB的量以10⁷细胞标定，表示为ng/10⁷细胞。

［注意事项］

1．本方法适用于肝癌增殖分化过程的机制研究以及肝癌增殖分化药物的筛选及评价。

2．这些指标均为肝癌特异性指标，特异性高，结合灵敏度高的酶学及放免法，使得上述方法准确可靠。