恶性肿瘤通常被认为是细胞分化异常，至少某些恶性肿瘤，例如急性非淋巴细胞性白血病，是其细胞分化受阻的结果。目前有多种肿瘤细胞，如畸胎瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、黏液表皮样癌、鳞状细胞癌、乳腺癌、结肠癌、肝癌等在体外可以被分化诱导剂诱导分化。目前发现的有效的分化诱导物质，常用的有维A酸类化合物（如维A酸）、环核苷酸衍生物（如双丁酰环核苷酸）、极性化合物（如DMSO )、促癌物（如佛波酯TPA）等。恶性肿瘤在分化诱导剂作用下，可出现恶性逆转表型，主要表现为生长抑制，具有特异的形态特征，产生特异的糖蛋白、酶及分泌物，出现一些正常细胞的生理功能等。肿瘤分化治疗，提供了一种替代或补充传统细胞杀伤治疗的新方法，与传统的化学治疗方法相比，具有独特的优点。分化诱导剂的发现和分化治疗的明显疗效，提供了用新型毒性小的化合物和现用的细胞毒药物低剂量治疗肿瘤的机会。联合应用低剂量化疗药物和分化诱导剂，对克服传统治疗方法所产生的耐药性具有明显的应用价值。肿瘤分化诱导剂的筛选鉴定，是肿瘤分化治疗方面基础研究的热点。建立合适的肿瘤细胞分化诱导模型是筛选发现理想的肿瘤分化诱导剂的必要条件。肿瘤分化诱导模型可分为体外分化诱导模型和体内分化诱导模型。本节简要介绍一些常用的分化诱导模型。

一、体外分化诱导模型

（一）白血病细胞分化诱导实验

HL60细胞为人早幼粒白血病细胞株，因分化诱导剂的种类不同可分化为不同类型的白细胞，也可分化为单核巨噬细胞，其分化指标包括形态学由早幼粒白血病细胞分化为中幼粒、晚幼粒、杆状核细胞或分叶核细胞；生物化学方面出现硝基蓝四氮唑(NBT）还原反应能力；功能方面出现吞噬功能及吞噬性等。一般来说，功能及生物化学变化早于形态学改变，其中以NBT还原能力测定最为常用，一个化合物是否有分化诱导作用，还应结合其形态学及功能两方面的改变来判断。

1. NBT还原能力测定HL-60细胞如果能被待测的分化诱导剂分化，其中的过氧化物酶就能使外源性的NBT还原为不溶性的蓝黑色颗粒，并沉着于细胞内有酶活性的部位，可在显微镜下清楚看到着色斑，并定量计数阳性百分率。

【材料】

（1）HL-60细胞株，RPMI 1640培养液，小牛血清。

(2)硝基蓝四氮唑(NBT)，实验时新鲜配制。NBT难溶于水，先用微量DMSO助溶再用生理盐水配制成0.1％浓度。

(3）佛波酯（TPA）丙酮溶液（200 ug/ml)。

(4) Wright-Giemsa染液。

(5）载玻片，吹风机。

【方法】

(1)细胞培养无菌条件下，收集对数增殖期细胞，用含10％灭活小牛血清的RPMI 1640培养液配制成1.0x10⁵/ml浓度的细胞悬液，分装于培养瓶内，每瓶5ml，每组平行2瓶。给药组加入不同浓度的药物，对照组加入等体积的溶剂。置37℃,5% CO₂孵箱内培养。

(2）于加药培养后不同时间，取各组细胞悬液，4℃,1000r/min离心5分钟，弃上清液。加入0.1 % NBT溶液0.5 ml, TPA溶液100 u1, 37℃温育1小时。

(3）将各实验组细胞离心，弃上清液，取细胞沉淀涂片，用吹风机迅速风干。

(4）常规染色Wright-Giemsa染色，蒸馏水冲洗，风干。

(5）油镜下每片观察200个细胞，细胞内染有蓝黑色颗粒者为NBT阳性细胞，计算阳性细胞百分率。

【结果分析】

对照组（未加药）的NBT阳性细胞不应超过10%，有效分化诱导剂组的NBT阳性细胞数应大于50%。

2．细胞形态学观察成熟的白细胞由造血干细胞分化而来。粒细胞一般按照原始粒细胞、早幼粒细胞、中幼粒细胞、晚幼粒细胞、杆状核及分叶核细胞逐渐分化成熟。一般认为白血病的发生与细胞分化受阻有关，细胞停止在早幼粒阶段而产生异常增殖的白血病细胞。HL-60细胞可在分化诱导剂的诱导下沿粒系方向逐渐分化为趋于成熟的细胞。

【材料】

HL-60细胞株，RPMI 1640培养基，小牛血清，Wright-Giemsa染液，载破片，吹风机。

【方法】

（1)实验步骤：

1)取经药物处理后的细胞悬液离心，弃上清液，取细胞沉淀涂片。

2) Wright-Giemsa染色10分钟，蒸馏水冲洗，风干。

3）油镜下每片观察200个细胞，按其分化成熟程度分类。

(2）细胞分类：各类细胞的形态特点如下：

1)早幼粒细胞：胞质少，呈淡蓝色或深蓝色，有非特异性嗜天青颗粒（呈紫红色，较粗大），核圆形或椭圆形，染色质多，核仁大而明显，1～3个不等。

2）中幼粒细胞：胞质较多，出现细小的粉红色颗粒；核呈圆形或椭圆形，有时偏向一侧，核染色质粗糙，核仁减少或消失。

3）幼粒细胞：胞体较小，胞质淡红色．特异颗粒增多，核呈肾形、豆形或黄瓜形。

4）杆状核细胞：胞质量多．呈淡红色，布满细小嗜中性颗粒。核弯曲，呈带状、s形、u形或w形。

5）分叶核细胞：胞质量多，胞核分2～5叶。

【结果评定】

对照组的早幼粒细胞应在90％以上。分化细胞包括小幼粒、晚幼粒、杆状核、分叶核细胞。细胞分化成熟程度越高，晚幼粒、杆状核及分叶核细胞所占比例越大，说明分化诱导剂的效果越好。

3．吞噬功能测定（聚苯乙烯颗粒法）中性粒细胞及单核细胞可吞噬异物，如微生物、墨汁、聚苯乙烯乳胶颗粒等。HL-60细胞经分化诱导剂作用后可显示吞噬能力。

【材料】

聚苯乙烯乳胶颗粒溶液，0.5％伊红PBS溶液，RPMI 1640培养基，直径3.5cm小平皿，载玻片，盖玻片等。

【方法】

(1)用药物处理细胞，方法同前。于加药后第5天收集细胞，测吞噬活力。

(2）取各组细胞悬液（含细胞数2x10⁵）离心，弃上清液，加入反应液（聚苯乙烯乳胶颗粒溶液／无血清RPMI 1640培养液，按2 ul/ml混合）。每管加入2m1，混匀后移入小平皿内，置37℃,5% CO₂孵箱内保温4小时，使细胞吞噬乳胶颗粒。

(3）收集细胞，离心，用PBS反复洗细胞（3～4次），充分洗去胞外的乳胶颗粒后，吸取少许细胞悬液到载玻片上，并滴加一小滴0.5％的伊红，快速用盖玻片盖上在油镜下观察200个细胞，细胞内有5个以上颗粒的为阳性细胞，计算各组阳性细胞百分率。