真核细胞染色体末端含有串连重复的DNA序列，称为特殊的DNA-蛋白质端粒结构。当正常体细胞分裂时，端粒的末端均会随每次的复制被逐渐缩短，端粒的定长可能与正常细胞的有限分裂代数（约50代左右）有关，待端粒结构缩短至最后时，细胞即不再能分裂，这从整体上也限制了机体寿命的长短。原核细胞、真核细胞中的某些种系，很多肿瘤细胞等获得了不死性，说明它们具有延长端粒的性能，能将新生的重复序列加到染色体的末端，这就是端粒酶（telomerase）的作用。端粒酶是一种位于所有真核细胞染色体末端的遗传成分。它通过防止DNA的异常重组和降解来保持染色质的稳定性和细胞的可变性。端粒酶是一依赖于RNA的DNA聚合酶，它合成于端粒的重复区的DNA链末端。在人体肿瘤细胞中测得端粒酶活性高达85%，这种超表达预示其可能对肿瘤细胞的增殖起重要作用。人的正常体细胞无端粒酶活性，这些酶的重新活化可能使细胞获得了无限分裂的能力，故端粒酶的活性检测，可被作为恶性肿瘤细胞增殖、转移的潜在标记。以下介绍PCR-ELISA法检测培养细胞的端粒酶活性。

【材料】

（一）试剂

1．细胞裂解剂10mmol/L Tris-HCI (pH 7.4)，10mmol/L EDTA,150mol/L NaCl, 0.6% SDS,100 ug/ml蛋白酶K。

2．反应混合物 含端粒酶基因引物Pl,P2(100pmol/L),4xdNTP(1.25mo1/L),Taq聚合酶3u，用Tris缓冲液稀释。

3. DNA变性剂 10mol/L NaOH (<0.5%）溶液。

4．杂交缓冲液 含有用地高辛（digoxin,Dig）标记的与端粒酶重复序列（Telomerase re-peat, TR )互补的DNA探针溶液。

5．清洗缓冲液0.02mo1/L Tris-HCl-Tween 20缓冲液（pH 7.4)。

6．过氧化物酶标记的抗地高辛抗体（羊多克隆抗体，稀释后抗体浓度约为0.5U/ml)。

7．稀释缓冲液含4% PEG (W/V聚乙二醇），PBS-Tween 20缓冲液（NaCl 8.0g KH₂PO₄ 0.2g, Na₂HP0₄·12H₂0 2.9g,Tween20 0.5m1、小牛血清100m1，加三蒸水至1000ml, pH7.4)。

8. TMB底物溶液四甲基联苯胺（TMB-H202 )溶液。

9．终止液2mol/LH₂SO₄。

10．阳性对照细胞提取物持续表达端粒酶活性的人胚肾细胞（293细胞株）冻干品，使用时用20ul三蒸水溶解，每ul中约含1x10³细胞当量。

（二）器皿与工具

1．包被微量板（microtiter plate, MTP)12x8孔条式微孔板，每孔先用链霉亲和素包被，后用封阻剂再包被，加干燥剂封膜。

2．自粘封孔盖箔( Self-adhesive cover foil)为避免微量反应液的蒸发，在EUSA操作的每次孵育过程中，应用黏性封孔箔将微孔封好。

3．可调微量移液器、无菌移液器吸头、无菌eppendorf管等。

（三）仪器

PCR扩增仪、酶免疫检测仪、台式低温离心机、冰浴盒、恒温水浴箱等。

【方法】

按试剂盒说明书操作。以下操作供参考。

（一）细胞提取物的制备

1．常规方法收集培养细胞，锥虫蓝染色测细胞活性并计数。每份检测样品转移2x106细胞至eppendorf管中，4℃ ,15 000r/min离心10分钟，小心吸弃上清液，用无菌PBS缓冲液再悬浮细胞，并重复离心步骤，小心吸弃上清液。

2．加200ul细胞裂解液将沉淀细胞重新悬浮，在预冷的冰浴里反复吹吸至少3次，并在冰上孵育30分钟以彻底裂解细胞。然后将裂解物经低温离心机，4℃ ,8000r/min离心20分钟，小心吸取上清液，移于另一新的eppendorf管中。

（二）端粒重复序列扩增方案（telomeric repeat amplification protocol, TRAP)

1．取1～3 w1细胞提取物（相当于1x10³～3x10³细胞当量）放入eppendorf管内，加入反应混合液25 u1（依次加入10x扩增缓冲液5 u1,4xdNTP 9 u1，引物P1和P2各5ul，Taq DNA聚合酶1ul），加无菌三蒸水22～24ul，使终体积为50ul，并使挂在管壁上的液滴沉下，管内液体充分混匀。

2．放入PCR扩增仪内，参照如下的循环参数（表9-4)，进行引物延伸／扩增反应。

（三）扩增产物DNA变性

取5 u1扩增产物置一新eppendorf管内，加20 u1变性剂（终浓度为0.1 mol/L NaOH）于室温下变性10分钟。

（四）DNA杂交

在25 ug变性DNA液中加杂交缓冲液225 u1，置37℃振荡器（300r/min )孵育2小时，以地高辛标记的特异序列探针与扩增的DNA进行杂交。

（五）ELISA检测

1．在已包被链霉亲和素的微量反应板上，每孔加100ul杂交混合物（杂交物的一方是生物素标记的引物扩增端粒重复序列，另一面是用地高辛标记的对端粒重复序列特异的DNA探针），于37℃孵育1小时。

2．甩干微量板各孔的杂交混合液，用清洗缓冲液洗板3次，每孔加清洗液250ul，每次洗30秒，并小心弃去清洗液。

3．每孔加100ul用过氧化物酶标记的抗地高辛抗体，用封孔箔覆盖MTP板，在室温18～22℃下振摇（300r/min )孵育30分钟。

4．弃去过氧化物酶标抗一地高辛抗体，用清洗缓冲液洗板5次，每孔加清洗液250ul。每次洗30秒，小心弃去清洗液。

5．每孔加100ul已预温的底物TMB-H₂0₂溶液，用封孔箔覆盖MTP板，于室温振摇(300r/min )孵育10～20分钟，并观察各孔的颜色变化。

6．当出现颜色反应（由蓝变黄）时，每孔加100ul终止液（2mol/L H₂SO₄）以终止反应。

7．用酶免疫检测仪测定，相对空白参照读取各试验孔、阴性与阳性对照孔的450nm波长的吸光度A值（参考波长690nm )。

【结果】

1．阴性对照孔（N）是指用RNA酶预处理的细胞提取物，彻底降解RNA（或用65℃ 10分钟破坏RNA)。N的最大吸光度为0.25单位。如果N的吸光度过高，应重新进行包括TRAP反应在内的整个实验。

2．阳性对照孔在底物反应20分钟后的吸光度应高于1.5单位，如果此值过低，也应重新进行包括TRAP反应在内的整个实验。

3．判定标准试验孔（细胞提取液）的吸光度（P）减去阴性对照孔吸光度（N）均数的差（△A) >0.2时，则视为试验孔的端粒酶阳性。