已经知道肿瘤细胞表面电荷的改变与转移的形成密切相关，肿瘤细胞的细胞电泳速度是反映其表面电荷改变的指标，故细胞电泳速度可作为筛选不同转移性肿瘤细胞的初筛试验。

【材料】

1．肿瘤细胞、正常细胞。

2. 0.01 mol/L pH 7.5 PBS溶液。

3．细胞电泳仪、无菌剪、镊子、细胞计数板、显微镜等。

【方法】

1．细胞的制备体外培养细胞或手术切除的新鲜肿瘤组织块，经剪碎、吹打、过筛网等方法制备成肿瘤细胞悬液，一般应避免酶消化法。肿瘤细胞用pH 7.5 PBS液洗涤3次，最后用PBS液再悬浮，使之形成游离单细胞悬液，经计数将细胞浓度调至1x10⁶/ml。同法制备正常细胞悬液。

2．细胞电泳仪用人工计数型电泳仪，在37℃条件下测定肿瘤细胞在电场中（加压20V)自由泳动一定距离的正向和反向各1次所需时间，根据下列公式计算细胞的电泳速度或电泳率。

当用全自动细胞电泳仪时，取2m1细胞悬液加样于测定部位，直接测出细胞速度或电泳率的平均值。正常细胞悬液作对照。

二、快速体外侵袭试验

快速体外侵袭试验又称双室培养侵袭试验。两室之间有一层有孔滤膜为基础的基底膜屏障，以肿瘤细胞穿过屏障的能力来判断其侵袭和转移的性能。

【材料】

1．待检肿瘤细胞。

2．双室培养瓶（transwell）上室底部为一层微孔滤膜，微孔直径8um。

3．基底膜基质凝胶（basement membrane matrigel)，纤连蛋白（fibronectin）或层粘连蛋白（laminin，LN)。

4．培养基、甲醇、Wright-Giemsa染液、显微镜等。

【方法】

1．待检肿瘤细胞制备将铺满瓶壁的单层细胞，经酶消化脱壁、吹打制成肿瘤细胞悬液1x10⁴/50 u1。

2．在下面的孔中加入27ul的完全培养基，加入一层微孔滤膜，也称有孔转移膜，加上胶垫，放好上面多孔板，拧好螺丝，在上孔上加细胞悬液50ul。

3．放置在37℃,5% CO₂孵箱内培养6小时，取滤膜，将上室面用细胞刮刮净，经甲醇溶液固定30分钟后，Giemsa染色，计数滤膜背面侵袭的肿瘤细胞数。

最近有报道改变基底膜屏障的组成及培养液成分的改良试验方法。如用大白鼠肠系膜中层细胞代替覆盖在滤膜表面的基质凝胶基底膜，以大鼠体内分离的细胞作为基底膜的再构物进行试验更接近体内状况。待肠系膜中层细胞长成单层时，则制成基底膜屏障。此时将大白鼠纤维肉瘤( fibrosarcoma )细胞接种于上室内，经培养后于显微镜下观察并计数滤膜背面侵袭的纤维肉瘤细胞数。

【结果】

Giemsa染色，计数侵袭的肿瘤细胞数。于光镜下将直径为13 mm的膜分成9等份格，分别计数4个角及1个中心方格内的侵袭细胞数，每组计数3份样品以上，求出平均数。

【注意事项】

1．肿瘤细胞侵袭与转移的检测最理想的方法是动物的体内实验，其次是体外的transwell实验。

2．在进行transwell实验时，加细胞悬液应该非常小心，里面不要有气泡，这是实验成败的关键步骤之一。

3．在进行transwell实验时，如果所用的细胞为悬浮培养的细胞，膜应该用纤连蛋白浸泡，使其易于细胞黏附。

三、球体器官培养侵袭试验

【材料】

1．待检肿瘤细胞或手术切除肿瘤组织块。

2．鸡胚（9日龄）。

3．培养液。

(1) RPMI 1640完全培养基（RPMI 1640+15％小牛血清+1% HEPES+青霉素l00IU/ml及链霉素100 ug/ml)。

(2）半固体琼脂培养基：取50ml含有40％小牛血清的2倍浓度的RPMI 1640培养液，加等量的加热溶化并保温在45℃水浴中的1％琼脂液，混匀后快速加入24孔培养板中，每孔lml，冷却后即成0.5％半固体琼脂培基。

4．旋转摇动培养仪，锥形管（5ml,50ml),HE染色系列，显微镜等。

【方法】

1．肿瘤细胞球体的制备将长满瓶壁的单层细胞经消化、吹打，制成细胞悬液。或将切除肿瘤组织经剪碎、消化、过筛网等方法制成细胞悬液。离心1000r/min, 5分钟，再悬浮，经细胞计数和锥虫蓝染色细胞活性检测，活性在95％以上，调整细胞浓度为（1～5)x10⁵/ml。取6m1悬液置50ml锥形管内，于37℃,5% C0₂,50% 0₂和45% N₂的旋转振摇（70r/min）培养仪内，培养72小时，可形成规则、完整的肿瘤细胞球体，选出直径约为0.2mm的球体，用培养液反复洗涤球体表面附着的细胞，备用。

2．靶细胞球体的制备取9日龄鸡胚心脏，在平皿内剪除大血管和心房部分，留心室，用Hanks液充分洗涤后，将鸡胚心室切成0.4mm直径的小块，加6ml RPMI 1640完全培养基，移至50ml锥形管中（每管约50～70个），于37℃，上述条件的旋转振摇（120r/min）培养仪内培养24小时，选出直径为0.4mm的圆形预培养鸡胚心肌块（preculture heart fragment,PHF)，备用。

3．侵袭试验取0.4mm的PHF与直径0.2mm的肿瘤细胞球体各1个，在24孔板的半固体培养基上紧密接触，在37℃,5% CO₂孵箱内培养4～6小时，即成为PHF与瘤细胞的球形复合体。

4．将上述成对的复合体移入5ml锥形管中，每管含1个，加1.5ml RPMI 1640完全培养基，于37℃,5% CO₂,50% 0₂和45% N₂的旋转振摇（120r/min）培养仪中培养，隔日换液，于不同培养时间取出复合体进行检查。

【结果】

一般使用常规组织学及免疫组化染色后进行组织学观察。瘤细胞球体侵袭PHF的过程大致分4个阶段，按瘤细胞侵袭PHF的广度和深度，一般可分为5级，将两者结合起来分析：

第一阶段为瘤细胞向PHF黏附（0级）：为单纯的PHF, PHF表面由移出的成纤维细胞包绕，其周围形成一层或数层扁平细胞，中心为心肌组织。瘤细胞球体与PHF仅为接触。

第二阶段为瘤细胞紧密固着于PHF表面（I级）：肿瘤细胞包绕成纤维细胞层，在接触部位肿瘤细胞尚未破坏外层细胞。

第三阶段为肿瘤细胞包绕PHF，并穿过PHF外周的成纤维细胞层（Ⅱ级）：肿瘤细胞占据或破坏了PHF周围的成纤维细胞层，其边缘凸凹不平，或成团的瘤细胞开始侵入心肌块。

第四阶段为瘤细胞向PHF的深层侵袭，最终取代PHF全组织（Ⅱ级）：肿瘤细胞侵入心肌块内，并取代或破坏心肌组织，其侵袭面积小于50%；（Ⅳ级）：肿瘤细胞大片侵袭心肌内，已取代或破坏心肌组织的面积大于50%，心肌细胞有坏死、变性或萎缩。

以上5级中，O、l级为非恶性侵袭；Ⅱ级以上属侵袭性，其中Ⅱ级为低侵袭性，Ⅲ级为中侵袭性，Ⅳ级为高侵袭性。此判断并非绝对，应根据不同瘤细胞的性能来决定。