羊红细胞（SRBC）可通过戊二醛交联技术与McAb或兔抗鼠IgG结合，制成致敏的SRBC。抗体致敏的SRBC可与T淋巴细胞直接或间接结合，在T淋巴细胞周围形成花环。通过计数花环形成率，从而确定T淋巴细胞各亚群。该方法可分为直接红细胞花环法和间接红细胞花环法。此处介绍间接花环法。

【材料】

1.醛化二抗致敏的SRBC。

2. May-Gruenwald染液。

3. Giemsa染液。

【方法】

1．将抗体致敏的SRBC悬液离心去上清液，用含20% NCS的RPMI 1640细胞培养液重悬，4℃备用；

2．用含20% NCS的RPMI 1640液将PBMC配成5x10⁴/ml置于玻璃平皿中，于37℃温育45分钟，吸出非黏附细胞置另一试管中备用。

3．将上述淋巴细胞悬液分别加入96孔细胞培养板中，每孔25ul，每份标本加3个复孔，再分别加入抗 CD3,CD4,CD8的McAb 25ul，同时设阴性对照，置4℃孵育30分钟。

4．取出，用RPMI 1640液洗涤3次，每次1000r/min离心1分钟，最后弃去上清液，每孔加入上述致敏红细胞悬液25ul，混匀，室温下孵育10分钟，500r/min离心10分钟，继续在室温下放置1小时，然后4℃过夜。

5．取出，轻轻悬浮，用May-Gruenwald和Giemsa染液染色。

【结果】

用高倍镜观察细胞：淋巴细胞周围黏附有3个以上SRBC者即为花环阳性细胞。共计数200个淋巴细胞，计算出花环形成细胞百分率，以确定T细胞各亚群的百分率。

MHC／多肽四聚体法检测抗原特异性T细胞数量

【原理】

成熟T细胞表面具有特异性识别抗原并与之结合的分子结构，称为T细胞抗原受体（Tcell receptor,TCR),T细胞通过其表面TCR特异性识别抗原呈递细胞表面的MHC／抗原肽复合物后，发生活化增殖，进而分化成效应细胞。因此，可以用MHC／抗原肽复合物检测T细胞表面的特异性TCR，来反映抗原特异性T细胞数量的变化。本方法的关键是MHC／多肽四聚体的合成：将体外表达的MHC重、轻链分子及短肽共孵育，使其折叠成正确的构象，形成MHC／多肽复合体，再经过纯化，并借助于半肽氨酸的巯基与生物素结合，然后将一个标记荧光的链霉亲和素与4个生物素标记的MHC-肽复合体结合形成四聚体。这种MHC／多肽四聚体与抗原特异性T细胞上的TCR结合后，即可通过灵敏度很高的流式细胞仪(FACS）进行检测。本法敏感性高，克服了传统方法的局限性，可用于各种抗原特异性T细胞表型分析、分离和克隆化，也可用于检测抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞数量，为研究与细胞免疫反应有关的一系列工作提供了高效、快速、敏感的研究手段。

【材料】

1．荧光素标记的MHC-肽四聚体：用含1% FCS,pH 7.4 PBS配成2mg/ml溶液。

2．洗涤液含1% FCS, pH 7.4 PBS。

3．固定液25％戊二醛3.2ml,葡萄糖2g加无BSA的细胞洗液至100m1。

【方法】

1．常规方法分离外周血单个核细胞，于各实验管中分别加入106 PBMC,1500r/min离心3分钟，弃上清液。

2．分别加入荧光素标记的MHC-肽四聚体50m1，混匀。

3. 4℃孵育60分钟，加入细胞洗液，1500r/min离心3分钟，反复洗涤3次。

4．用细胞洗液恢复体积至0.5ml，加入固定液20m1,混匀。

【结果】

用流式细胞仪检测。