胸腺嘧啶核苷(TdR）是DNA特有的碱基，也是DNA合成的必需物质。用核素³H标记TdR即³H-TdR作为DNA合成的前体能掺入DNA合成代谢过程，通过测定细胞的放射性强度，可以反映细胞DNA的代谢及淋巴细胞增殖情况。

【材料】

1. ³H-TdR（比活性为2～10Mci/mg分子）3H-TdR工作液：将1Mci/ml溶液以生理盐水稀释成100 uci/ml，于4℃保存备用。临用时再用培养液稀释成10 uci/ml溶液，³H-TdR一般临用时稀释；

2．闪烁液 PPO(2,5-二苯基噁唑）,POPOP(1,4-双-15-苯基噁唑）。ppo 5.Og popop 0.1～0.3g加二甲苯或甲苯至1L;POPOP加入少量二甲苯在37℃水浴上溶解后，再加PPO,然后补足二甲苯。配好的闪烁液需要闭光。闪烁液配制和检测的样品有关；

3．其他5％三氯醋酸；3％冰醋酸；浓甲醛;30%H₂0₂液等。

【方法】

1．常规分离淋巴细胞（可来自外周血，脾细胞等）。

2．洗涤后用10% FCS RPMI 1640调整合适细胞数（2x10⁶/ml)。

3．加入96孔培养板中，2x10⁵/100 u1/孔，每组设3个复孔。

4．加入最适剂量PHA或Con A ,100 ul/孔，同时设不加PHA或Con A阴性对照，一般每孔最终体积为20O ul（细胞终浓度1x10⁵),37℃,5% C0₂孵育，66小时（20小时后加药处理）。

5．每孔加入0.5～1 uci 3H-TdR(50 u1）继续培养6～12小时。

6．培养结束后，离心吸去上清液，用200ul冷PBS洗涤两次（2000r/min离心10分钟）用冷PBS可以终止反应。

7．用多头细胞收集仪收集样品于玻璃纤维滤纸（膜）上。至少洗涤2次。

8．取出滤膜，排列好，置于干燥箱中，60～80℃,30分钟烘干（75℃烤箱过夜）。对号剪下各个滤膜片，然后将滤膜放入装有5 ml的闪烁液中（贴细胞的面朝上）。闪烁瓶暗处放置15分钟。

【结果】

用液闪仪计数（测定放射性cpm值）。增殖水平直接用每分的脉冲数cpm值表示，再按标本淋巴细胞计数结果，校正成每百万淋巴细胞的脉冲数（cpm/10⁶淋巴细胞）。取各管测定数的平均值。也可用刺激指数（SI）表示试验结果

以SI表示结果时，一定要设置相同数量培养孔的对照（即不加Con A/PHA)。而以cpm绝对值表示（cpm/10⁶淋巴细胞）则可以不用设对照管。因为对照的cpm与本底比较接近，不同样品之间的少许差别也不易确定其意义。

【注意事项】

1．采用手工裁剪大小合适的玻璃纤维膜。废液瓶和真空泵之间最好加一个缓冲瓶，不要直接将真空泵上的橡胶管连接到废液瓶上，以免放射性废液进入橡胶管。

2．在加入闪烁液之前必须烘干滤膜，但加入一定量的醇类（如无水乙醇），则可容纳少量的处理后所残留的水分，但也仍需烘至接近干燥的程度，否则将发生混浊而无法测定。

3．丝裂原在正式实验前均需摸索最适剂量或亚适剂量。厂家和批号不同丝裂原作用常有很大差别。根据实验需要，不同来源淋巴细胞（胸腺、脾脏、淋巴结、扁桃体、外周血等）均应进行最适细胞浓度、培养时间和刺激物浓度的摸索。

4．在细胞分裂周期中只有S期合成DNA，故在S期加入³H-TdR，加入过早不但不能被细胞摄取，反而被降解为胸腺嘧啶，不能作为合成DNA的原料。一般在培养终止前6至16h加入³H-TdR，其掺入量高。

5. ³H-TdR需准确加样，严格控制实验条件，冲洗抽滤去除未掺入的³H-TdR要充分。